異型南五味子總三萜對類風濕關節炎小鼠抗炎鎮痛藥效學研究

鄧鳴，張煒寧

(深圳市福田區中醫院，廣東 深圳　518034)

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異型南五味子總三萜對類風濕關節炎小鼠抗炎鎮痛藥效學研究

鄧鳴，張煒寧

(深圳市福田區中醫院，廣東 深圳518034)

目的觀察異型南五味子總三萜的抗炎鎮痛的藥效。方法昆明小鼠180只隨機分為五組，包括空白對照組、陽性藥對照組(1 mg·kg-1吲哚美辛)、總三萜組(高6 mg·kg-1、中3 mg·kg-1、低1 mg·kg-1三個劑量)，通過二甲苯致小鼠耳腫脹實驗、醋酸致小鼠扭體反應實驗、熱板法測定小鼠痛閾值考察異型南五味子總三萜的抗炎鎮痛效果。結果在改善小鼠耳腫脹度、扭體潛伏期、扭體反應的次數、扭體發生率、不同時間痛閾值等方面，總三萜各劑量組治療前后比較，差異有統計學意義(P<0.05),治療后總三萜各劑量組與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，治療后總三萜高劑量組與陽性藥對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論異型南五味子總三萜對小鼠的急性炎性反應、物理化學性刺激引起的疼痛有抑制作用，總三萜高劑量具有明顯的抗炎鎮痛效果。

地血香/藥理學;關節炎,類風濕;小鼠

類風濕關節炎是一種慢性自身免疫性疾病，主要表現為關節滑膜的慢性炎癥，軟骨和骨破壞，可造成關節畸形和功能障礙[1]。近年來該病的發病率有逐年增加的趨勢[2]。我國類風濕關節炎患病率約0.2%～0.4%[3]，發病初期表現為進展性關節損害，影響日常工作，如不給予適當治療，病情逐漸發展加重，最后將導致畸形、關節強直和功能喪失，甚至死亡[4]。目前臨床針對類風濕性關節炎有西醫治療藥物但毒副作用較大，因此，開發高效、低毒的新型抗類風濕性關節炎的藥物意義重大。異型南五味子是少數民族長期用于治療風濕痹痛等疾患的民間特色藥物，其有效成份為總三萜，常用于治療風濕痹痛、骨痛、風濕性關節炎、腰肌勞損、產后痹等[5]。我們開展異型南五味子提取物總三萜治療類風濕關節炎小鼠模型的抗炎鎮痛研究，以探討總三萜治療類風濕關節炎的藥理作用，現將結果報告如下。

1　材料與方法

1.1動物與分組選用昆明小鼠180只，體質量(180±20)g，雌雄各半，動物來源為廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(粵)2013-0002，實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2013-0002。動物在實驗前適應性馴養1周，動物房溫度和濕度分別維持在20 ℃和70%左右。按照三個實驗研究均隨機分為5組，包括空白對照組、陽性藥對照組(1 mg·kg-1吲哚美辛)、總三萜組(高6 mg·kg-1、中3 mg·kg-1、低1 mg·kg-1三個劑量)。

1.2實驗方法

1.2.1二甲苯致小鼠耳腫脹實驗取昆明小鼠60只，隨機分為5組，包括空白對照組(給予等體積純水)、陽性藥對照組(1 mg·kg-1吲哚美辛)、總三萜組(高6 mg·kg-1、中3 mg·kg-1、低1 mg·kg-1三個劑量),每組動物12只，灌胃給藥，連續7 d。末次給藥1 h后乙醚麻醉小鼠，于小鼠左耳前后兩面涂抹二甲苯0.05 mL，右耳作對照，30 min后將小鼠頸椎脫位處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑6 mm的打孔器分別在左、右耳同一部位打下圓耳片，稱重，以左右耳片重量之差為腫脹度。

1.2.2總三萜鎮痛作用研究(1)扭體法實驗:取昆明小鼠60只，處理同上。末次給藥1 h后，小鼠腹腔注射0.7%冰醋酸溶液0.2 mL/10 g，記錄注射冰醋酸后扭體反應發生的潛伏期、30 min內各組小鼠出現扭體反應的次數(腹部收縮內凹、軀干與后腿伸張、臀部高起)以及扭體發生率，統計分析其抑制率。(2)熱板法篩選30 s內舔后足的昆明小鼠60只，分組情況同上。調節恒溫水浴(55±0.5) ℃，將普通燒杯底部接觸水面，先測量給藥前痛閾值，按照扭體法給藥劑量一次給藥，于給藥后30、60、90、120 min分別測定各鼠的痛閾值，計算不同時間點的痛閾提高百分率。結果進行統計學處理。

2　結果

2.1總三萜抗炎作用研究(對二甲苯致小鼠耳腫脹影響對比)經單因素方差分析，陽性藥對照組、總三萜各劑量組與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，說明陽性藥對照組及總三萜各劑量組能明顯抑制二甲苯引起的小鼠耳腫脹。總三萜低劑組與空白對照組比較，差異有統計學意義(P=0.037<0.05)；總三萜高劑量組與陽性藥對照組比較，差異有統計學意義(P=0.013<0.05)，說明總三萜各劑量組抑制二甲苯致小鼠耳腫脹的作用弱于陽性藥對照組，結果見表1。

表1　二甲苯致小鼠耳腫脹影響比較

注：腫脹度整體比較為單因素方差分析，抑制率則為整體χ2檢驗。

2.2總三萜鎮痛作用研究(對醋酸致小鼠扭體反應影響對比)經單因素方差分析，陽性藥對照組、總三萜高劑量組小鼠的扭體潛伏期與空白對照組比較，差異有統計學意義(P=0.001)；總三萜低劑量組小鼠的扭體潛伏期與空白對照組比較，差異有統計學意義(P=0.016)。說明總三萜各劑量組均能明顯延長小鼠的扭體潛伏期,抑制醋酸引起的扭體反應。總三萜各劑量組扭體潛伏期與陽性藥對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。陽性藥對照組、總三萜各劑量組扭體次數與空白組比較，差異有統計學意義(P=0.00)。總三萜各劑量組可明顯堅守醋酸所致的小鼠扭體反應次數，對醋酸所致疼痛有顯著的鎮痛作用；總三萜高劑量組扭體次數與陽性藥對照組比較，差異無統計學意義(P=0.98)，鎮痛效果相近。綜合來看，各用藥組均可明顯減少小鼠的扭體次數，延長小鼠的扭體潛伏期，但總三萜中、低劑量組扭體發生率達50%以上，陽性藥對照組的鎮痛作用強于總三萜的各劑量組，但與總三萜高劑量組比較，鎮痛作用差異無統計學意義，結果見表2。

表2　醋酸致小鼠扭體反應影響比較

注：扭體發生率比較為整體χ2檢驗，其它指標整體比較為單因素方差分析。

2.3總三萜鎮痛作用研究(對熱板致小鼠痛閾對比)陽性藥對照組給藥后痛閾值與給藥前相比,差異有統計學意義(P<0.01)；總三萜高劑量組給藥后90、120 min的痛閾值與給藥前痛閾值比較，差異有統計學意義(P<0.01)。與空白組對照比較，陽性藥對照組給藥后痛閾值與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，總三萜高劑量組給藥后痛閾值與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，中低劑量組在給藥后痛閾值30、60、90、120 min與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。與陽性藥對照組比較，總三萜各劑量組在給藥后90 min和120 min的痛閾值提高，差異有統計學意義(P<0.05)，總三萜高、中、低三個劑量組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。結果見表3。

3　討論

目前臨床針對類風濕性關節炎西醫治療藥物如非甾體抗炎藥物、抗風濕藥、糖皮質激素類，雖然有一定的治療作用，但毒副作用較大；中藥針對痹癥的臨床治療如雷公藤多苷片、益腎鐲痹丸等，療效局限，且有一定毒性。因此，開發高效、低毒的新型抗類風濕性關節炎的藥物意義重大。以中藥為主的天然藥物不僅來源廣泛、不良反應小，而且具有多環節、多靶點整體調節的特點，因此在治療類風濕關節炎方面有著獨特的優勢。

表3　熱板致小鼠痛閾影響比較±s

注：組間整體比較均為單因素方差分析。

我們對少數民族藥用資源進行調查的過程中，“血筒”的民間用藥特色引起了我們的關注。該藥資源豐富，民間有習慣用于治療風濕痹痛、慢性腰腿痛等痛癥的基礎，千百年來，少數民族中醫藥知識都是靠“口口相傳”來“代代豐富”的，許多醫藥知識流散于民間，常用草藥就有300種之多[6]，至今仍對人民的衛生保健事業發揮著重要作用。本課題組通過對粵北、湘西北少數民族聚居區的調研和野外實地考察，深感少數民族醫藥的原始、自然、神奇，有許多寶貴的民族醫藥資源值得我們去挖掘，他們常年居住在大山之中，山林間濕熱蒸郁，易感受風寒、濕邪而致身痛、身重，關節疼痛、屈伸不利等，為此，有自己的防治手段和藥物，如“三十六血”以及土家族“七”類藥都是具有活血散瘀、消腫、止痛等功效的藥物[7-8]。“血筒”又名“血七”、“血通”，是經典民族藥物中“三十六血”藥以及“七”類藥之一，經鑒定為異型南五味子，隸屬五味子科南五味子屬。民間以藤莖入藥，味甘、微辛，性溫，具有補血活血、祛風除濕、行氣止痛之功效。常用于治療風濕痹痛等病。是我國傳統中藥“雞血藤”的主要來源植物[9]。南五味子屬植物主要含有三萜和木脂素類化合物[10]，異型南五味子的主要成分為三萜類化合物。其中主要是針對三萜類化合物的細胞毒活性以及抗HIV作用開展了研究[11]，并已在南五味子屬中發現了大量具有抗HIV活性及較好細胞毒活性的三萜化合物。南五味子屬植物“血筒”能“祛風鎮痛，舒筋活絡,主治風濕痹痛，慢性腰腿痛，胃痛，腹痛，痛經”；“祛風除濕，理氣止痛，活血散瘀,主治風濕筋骨疼痛，腰肌勞損，坐骨神經痛，急性胃腸炎，慢性胃炎，胃、十二指腸潰瘍，痛經，產后腹痛，跌打損傷”；“行氣活血，消脹止痛,用于腹痛腹脹，肝炎，關節疼痛，勞傷腰痛等癥”。土家族等少數民族用其治療關節疼痛、頭痛、胃痛、腹部肌肉疼痛等已有多年的使用經驗，其療效和安全性得到實踐的確認。但到目前為止，與這些民間習用相關的活性成分結構，藥效評價、毒性研究均未見報道。

為此，我們在前期對異型南五味子化學成分及質量標準的研究基礎上，開展“血筒”總三萜與民間傳統用途相關聯的治療類風濕關節炎的藥效學實驗研究；并開展總三萜對動物急性、長期毒性試驗的毒理學研究，以考察異型南五味子總三萜的藥理活性和安全性，為開發具有自主知識產權的、安全有效的類風濕性關節炎治療藥物奠定基礎。類風濕關節炎臨床上急性發作期多以多關節腫脹，疼痛為發病特點，在急性發作期以急則治其標的原則，臨床治療多以抗炎,鎮痛為主要治療目的。因此，本課題藥理學實驗設計了急性期炎癥疼痛模型，即二甲苯致小鼠耳腫脹、醋酸致小鼠扭體反應、熱板致小鼠疼痛，以觀測異型南五味子總三萜對急性炎癥疼痛的抑制作用。實驗結果表明總三萜各劑量組對小鼠耳腫脹抑制作用明顯，對急性炎癥有明顯抑制效果。而總三萜高劑量組可明顯延長小鼠的扭體潛伏期、減少扭體次數、抑制小鼠的扭體反應，并且提高小鼠的痛閾值，對物理、化學性刺激引起的疼痛有明顯的鎮痛效果。

綜上所述，異型南五味子在民間有很好的治療風濕痹痛及各種痛癥的應用基礎，且鑒于三萜類成分是其主要成分，我們選擇其總三萜首次開展抗類風濕性關節炎的抗炎鎮痛藥理研究，實驗證明異型南五味子總三萜能有效抑制急性炎癥和疼痛，下一步研究需在確定有效部位的前提下，進一步分離篩選活性結構，為創新藥物的發現和研發打下基礎，也對異型南五味子屬藥用植物的開發研究起到示范性作用，更為治療類風濕關節炎等各種疼痛疾患發掘高效低毒的民間藥物打下基礎。

[1]張玉萍,姚茹冰,趙智明,等.IL-17在類風濕關節炎中的研究進展[J].安徽醫藥,2016,20(3):580-582.

[2]楊德勝.土家族藥物發展研究[J].湖南中醫雜志,2006,22(3):98-101.

[3]中華醫學會風濕病學分會.類風濕關節炎診斷及治療指南[J].中華風濕病學雜志,2010,14(4):265-270.

[4]Myasoedova E,Crowson CS.Epidemiology of rheumatoid arthritis: Rheumatoid arthritis and mortality[J].Current Rheumatol Reports,2010,12(5):379-385.

[5]熊鵬輝.土家族“七”類藥物考[J].中國民族醫藥雜志,2007,13(2):40-43.

[6]田華詠.土家族藥文化資源的開發與保護[J].中醫藥導報,2005,11(5):77-80,88.

[7]藤建桌,李金荃.湘西土家族藥物“三十六血”的整理與研究[J].中國民族醫藥雜志,2002,8(2):22.

[8]楊竟生.雞血藤膏及其原植物調查[J].藥學通報,1993,9(3):1271.

[9]蔣仕麗,章蘊毅,陳道峰.異型南五味子丁素、五味子酚和(+)-安五脂素對血小板聚集的影響[J].復旦學報(醫學版),2005,32(4):467-470，478.

[10] 羅藝萍,王素娟.異型南五味子的化學成分研究[J].云南大學學報(自然科學版),2009,31(4):406-409.

[11] Xiao WL,Li RT,Huang SX,et al.Triterpenoids from the Schisandraceae family[J].Natural Products Reports,2008,25:871-891.

Pharmacodynamics of alien kadsura total triterpenes used for anti-inflammatory analgesia in mice suffering from rheumatoid arthritis

DENG Ming，ZHANG Weining

(FutianTCMHospital，Shenzhen，Guangdong518034,China)

ObjectiveTo observe anti-inflammatory analgesic effect of Alien kadsura total triterpenes.MethodsA total of 180 mice from Kunming were randomized into 5 groups,including blank control group,positive control group (1 mg·kg-1indomethacin),total triterpenoid group (high,medium and low doses,6 mg·kg-1,3 mg·kg-1and 1 mg·kg-1,respectively).We examined anti-inflammatory analgesic effect of aliens kadsura total triterpenoid through Xylene induced mouse ear swelling experiment,body torsion induced by acetic acid and measurement of mice pain threshold by hot plate method.ResultsThere were significant differences among groups with different doses in improvement of the mouse ear swelling,incubation period of body torsion,the number of body torsion reaction,the incidence of body torsion,and pain threshold at different time before and after treatment (P<0.05).After treatment there were significant differences between groups with different doses and blank control group (P<0.05) while there was no significant difference between high dose group and positive control group (P>0.05).ConclusionsAlien kadsura total triterpenes has inhibitory effect on acute inflammation and pain caused by physical or chemical stimulation of mice,therefore,high dose of total triterpene has obvious anti-inflammatory analgesic effect.

Kadsura heteroclita/pharmacology;Arthritis,rheumatoid;Mice

2014年廣東省科學技術廳項目(2014A020220178)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.013

2016-05-22，

2016-06-20)