通脈對治療血瘀證的抗血小板聚集和體外血栓作用的研究

張小梅，李炎坤

(1.荊州市第一人民醫院心內科，湖北 荊州　434000；2.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧　437100)

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通脈對治療血瘀證的抗血小板聚集和體外血栓作用的研究

張小梅1，李炎坤2

(1.荊州市第一人民醫院心內科，湖北 荊州434000；2.湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧437100)

目的研究通脈不同部位抗血小板聚集和抗體外血栓作用。方法采用二磷酸腺苷(ADP)誘導家兔血小板聚集,測定通脈不同部位對血小板聚集的抑制率；采用體外血栓法、全血血塊法,觀察通脈不同部位的抗血栓作用。結果通脈石油醚部位和正丁醇部位有顯著的抑制血小板聚集和抗血栓作用，高劑量石油醚部位和正丁醇部位對血小板聚集抑制率及體外血栓溶解率均>50% ，差異有統計學意義(P<0.01)，高劑量正丁醇部位48 h全血凝塊溶解率>65%，差異有統計學意義(P<0.01)。結論通脈石油醚部位和正丁醇部位具有較強的抗血小板聚集和抗血栓作用。

川芎;葛根;丹參;血小板聚集抑制劑;血栓形成;催化域;兔

通脈方由川芎、葛根、丹參3味中藥材組成，具有活血通脈的功效，川芎活血祛瘀行氣開郁祛風止痛，葛根解肌退熱，透疹，生津止渴，升陽止瀉。丹參活血祛瘀，通經止痛，清心除煩，涼血消癰。三味藥組成通脈方，在臨床上用于缺血性心腦血管疾病、動脈硬化、冠心病等的治療。現代醫學認為，中醫血瘀證與循環障礙密切相關，循環障礙是血瘀證實質的重要組成部分[1]。其中血小板在血液循環及微循環障礙的各個環節中起重要作用，活化的血小板能促進血小板聚集和血栓形成，因此血小板活化是血瘀證產生的重要病理生理基礎[2]。為進一步對通脈活性部位進行研究，本文從抗血小板聚集和抗體外血栓兩個方面對通脈方治療血瘀證活性進行考察，對其不同部位活性進行了探討。

1　材料與方法

1.1動物家兔8只，雄性，體質量1.5～2.0 kg，購自武漢生物制品研究所，動物合格證號：SCXK(鄂) 2008-0003。 血小板聚集抑制實驗、通脈對血栓溶解作用這兩個實驗中各使用了3只家兔，通脈對全血凝塊的溶解作用研究中使用2只家兔。

1.2試藥ADP，4 5'-腺甘二磷酸二鈉鹽(Sigma公司，批號A22754)；凝血酶凍干粉(長春遠大國奧制藥有限公司，批號20140801)；纖維蛋白原(江西博雅生物制藥股份有限公司，批號20140304)；枸櫞酸鈉(國藥集團試劑有限公司，批號120413)；川芎、葛根、丹參(湖北天濟中藥飲片有限公司，批號分別為20140713、20141102、20150108)；阿司匹林(廣東九明制藥有限公司，批號140701)。

1.3供試品制備干燥的川芎、葛根、丹參各200 g，粉碎后用95%乙醇冷浸提取3次，每次7 d，提取液減壓濃縮成浸膏120 g，將其用熱水混懸，依次用極性遞增溶劑石油醚、氯仿、正丁醇萃取并減壓濃縮各萃取液，得各萃取部位，其中石油醚部位25 g，氯仿部位30 g，正丁醇部位35 g。

1.4血小板聚集抑制實驗[3]家兔耳緣靜脈采血，全血按9∶1加入3.8%抗凝劑枸櫞酸鈉，混勻，800 r·min-1離心5min，取上清，即為富血小板血漿(PRP)，備用；剩余血液繼續3 000 r·min-1離心10 min，得貧血小板血漿(PPP)，備用。然后將實驗分5組，分別為空白對照組、阿司匹林陽性對照組和通脈石油醚部位組、氯仿部位組、正丁醇部位組(低、中、高劑量組即5、10、20 mg·L-1)，以0.5% 二甲基亞砜(DMSO)作為溶媒，每組6個平行樣。精密吸取15 μL溶媒、阿司匹林和不同濃度的通脈方石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位分別加入到270 μL PRP中，在37 ℃比濁杯內孵育5 min，用PPP調零，再加入誘導劑二磷酸腺苷(ADP)溶液15 μL，按比濁法測定血小板聚集率，記錄5 min內最大聚集率。

血小板聚集抑制率=(對照組聚集率-藥物組聚集率)/對照組聚集率× 100%

1.5體外抗血栓作用

1.5.1對血栓溶解作用[4]家兔耳緣靜脈采血置試管中，全血按9∶1加入3.8%抗凝劑枸櫞酸鈉，然后依次加入0.5%纖維蛋白原溶液20 μL，55.5 g·L-1CaCl2溶液10 μL，1×105U·L-1凝血酶溶液20 μL，混勻。將全血注入到內徑為8 mm的聚乙烯管中，于37 ℃水浴20 min后取出血栓，切成1.5 cm的小段，放入各裝有2 mL不同濃度石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位的藥物溶液，阿司匹林溶液和生理鹽水溶液中，37 ℃溫育4 h后分別測定剩余血栓段的質量，計算血栓溶解率。

血栓溶解率=(血栓初始質量-藥物作用后血栓質量)/血栓初始質量× 100%

1.5.2對全血凝塊的溶解作用[5]家兔采血20 mL置于表面皿中，2 h后自然凝固后切成0.3 cm3的小塊，用生理鹽水淋洗3遍待用。將不同質量濃度的石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位及生理鹽水各2 mL加入不同西林瓶中，每組6個平行樣，再向各瓶中隨機加入2個血塊，37 ℃水浴保溫，觀察血塊溶解情況，并分別于 0、12、24、48 h 測血塊的質量，計算全血凝塊溶解率。

全血凝塊溶解率=(血凝塊初始質量-藥物作用后血凝塊質量)/血凝塊初始質量× 100%

2　結果

2.1通脈不同部位對血小板聚集抑制作用通脈方的各提取部位對ADP誘導的血小板聚集均有抑制作用，石油醚部位和正丁醇部位作用最顯著，在濃度為20 mg·L-1時，石油醚部位抑制率為50.9%(P<0.01)，正丁醇部位抑制率高達56.1%(P<0.01)。各部位血小板抑制作用均與濃度呈正相關性。見表1。

表1　通脈不同提取部位對ADP誘導的血小板聚集抑制作用

注：與對照組比較aP<0.05，bP<0.01。

2.2通脈不同提取部位對體外血栓溶解作用將血栓置于不同溶液中4 h后,結果顯示通脈不同部位均有不同程度的溶解體外血栓作用，正丁醇部位對體外血栓的溶解作用尤其顯著，差異有統計學意義(P<0.01)，即使在低濃度5 mg·L-1時其血栓溶解率也大于50%，并有明顯量效關系。見表2。

表2　通脈不同提取部位對體外血栓溶解作用

注：與對照組比較aP<0.05，bP<0.01。

2.3對全血凝塊的溶解作用石油醚部位高劑量組對血凝塊有顯著溶解作用(P<0.01)，正丁醇高劑量組(濃度20 mg·L-1)的血凝塊在12 h后體積縮小約20%，24 h 后體積縮小約40%，48 h后體積縮小約65%(P<0.01)，此時血栓呈分散狀態。中、低劑量實驗組的血凝塊體積也明顯的縮小。但生理鹽水對照組血凝塊變化不大。石油醚高劑量組及正丁醇組全血凝塊溶解率的組間差異有統計學意義，顯示石油醚及正丁醇部位對全血凝塊有明顯的溶解作用，且呈濃度依賴性。見表3。

表3　不同部位對全血凝塊的溶解作用

注：與對照組比較aP<0.05，bP<0.01。

3　討論

血小板聚集在血栓形成過程中發揮著至關重要的作用，而血栓形成是許多疾病如心肌梗死、缺血性猝死、腦卒中、冠心病、動脈粥樣硬化等的直接原因，嚴重危害著人類的健康。

通脈方由丹參、川芎、葛根組方而成，具有活血通脈的功效。臨床上用于缺血性心腦血管疾病的治療，對動脈硬化、腦血栓、腦缺血、冠心病、心絞痛等有較好的療效。通脈方中各藥材的化學研究及藥理研究表明，葛根素為代表的異黃酮類是葛根中的主要成分，具有多種心血管藥理活性[6-7]；酚酸類成分是丹參中的主要活性成分，具有抗血小板聚集和血管舒張作用[8-10]；阿魏酸、川芎嗪是川芎主要成分，具有抗血小板聚集、抗血栓及降血脂等多種心血管系統活性[11-12]，有研究表明通脈中葛根異黃酮類和丹參素是吸收入血的主要成分[13]。本研究通過不同極性溶劑將通脈中不同極性的成分聚集，希望了解通脈抗血小板聚集及體外溶栓作用的活性部位。實驗結果顯示通脈三個萃取部位均有不同程度的抗血小板聚集及體外溶栓作用，其中石油醚部位和正丁醇部位活性最為顯著。這可能是因為石油醚部位為低極性部位，丹參多酚酸類化合物及揮發油類成分集中在石油醚部位[14]；正丁醇部位極性較高，葛根素及黃酮類化合物主要存在正丁醇部位[15]，因而這兩個部位顯示出較好的活性。

通脈方是由丹參、川芎、葛根組成的中藥復方，對其活性部位的研究有助于了解其活性物質基礎，下一步可在本研究的基礎上，對活性部位進行分離得到的單體化合物，進行相關活性篩選及機制的研究。

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Active site of Tongmai for antiplatelet aggregation and antithrombosis

ZHANG Xiaomei1,LI Yankun2

(1.DepartmentofCardiology,TheFirstPeople’sHospital,Jingzhou,Hubei434000,China;2.SchoolofPharmacy,HubeiUniversityofScienceandTechnology,Xianning,Hubei437100,China)

ObjectiveTo study the active site of Tongmai for antiplatelet aggregation and antithrombosis.MethodsThe inhibition rates of platelet aggregation of different parts were determined by ADP-induced platelet aggregation of rabbit.The antithrombosis of different fractions were observed by means of thrombus in vitro and whole blood gore.ResultsThe petroleum ether fraction and the n-butanol fraction have significant inhibition of platelet aggregation and thrombosis,the platelet agglutination inhibition rates and the thrombus dissolution rates of petroleum ether fraction and n-butanol fraction at high dosage were both superior to 50%(P<0.01).The whole blood gore dissolution rate of n-butanol fraction at high dosage was more than 65%(P<0.01).ConclusionsThe petroleum ether fraction and n-butanol fraction have significant inhibition of platelet aggregation and thrombosis.

Ligusticum chuanxiong;Pueraria lobata;Salvia miltiorrhiza;Platelet aggregation inhibitors;Thrombosis;Catalytic domain;Rabbits

湖北省自然科學基金面上項目(2014CFB186)

李炎坤，男，博士，副教授，研究方向：心腦血管藥理學，E-mail：yxyliyk@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.009

2016-05-29，

2016-06-17)