Angiopep-2介導的雙靶向納米載體研究及其在大鼠C6膠質瘤MR顯像中的價值

張婧婧，王嘯，徐云霞，余永強，錢銀鋒

(安徽醫科大學第一附屬醫院放射科，安徽 合肥　230022)

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Angiopep-2介導的雙靶向納米載體研究及其在大鼠C6膠質瘤MR顯像中的價值

張婧婧，王嘯，徐云霞，余永強，錢銀鋒

(安徽醫科大學第一附屬醫院放射科，安徽 合肥230022)

目的制備Angiopep-2介導的雙靶向納米載體對比劑，并從細胞和動物水平評估其在膠質瘤顯像中的價值。方法制備有和無Ang包裹的聚N,N-二乙基丙烯酰胺納米對比劑(NP、Ang-NP)。分別測定C6細胞株和腦毛細血管內皮細胞(BCECs)與NP、Ang-NP共培養不同時間的熒光強度；C6細胞球對Ang-NP攝取率和競爭抑制實驗；對C6膠質瘤大鼠模型行標注Ang和Gd3+的納米合成造影劑(Ang-NP-Gd)和扎特酸葡酸(DOTA-Gd)增強掃描，比較兩組腫瘤的CNR及對腫瘤邊界顯示情況。結果C6細胞及血管內皮細胞對Ang-NP-FITC均有明顯的攝取；C6腫瘤球對三組攝取率順序為：Ang-NP>NP>Ang-NP +Angiopep-2；Ang-NP-Gd顯示腫瘤邊界較DOTA-Gd更清晰；CNR隨時間增大，在12 h達峰值。結論Angiopep-2與血管內皮細胞及膠質瘤細胞的低密度脂蛋白受體相關蛋白-1受體結合，具有很強的穿透血腦屏障及進入腦膠質瘤的能力。

磁共振成像/方法;納米共軛體;神經膠質瘤;分子靶向治療;大鼠,Sprague-Dawley

膠質瘤是成人中樞神經系統最常見的原發性腫瘤，發病率為(5～10)/10萬人[1]；膠質瘤多呈侵襲性生長，具有不易早期診斷、治療效果差、易復發、高死亡率等特點[2]。目前將Gd與納米聚合物結合的納米系統是研究腦腫瘤顯像的熱門方法，但是僅僅將藥物與納米粒子連接形成的非靶向納米聚合物對比劑的顯影效果仍不理想。為了提高納米聚合物靶向效能，納米聚合物需結合具有特殊功能的配體，常分為細胞穿透肽和主動靶向性配體。前者主要是通過提高細胞膜通透性，但缺乏對正常及異常細胞的選擇性；而主動靶向性配體是通過腫瘤細胞上特殊的靶向受體-配體效應而得名，用于增加血腦屏障(brain blood barrier,BBB)的通透性[3]。低密度脂蛋白受體相關蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein,LRP)在脂蛋白、蛋白酶/蛋白酶抑制劑復合體、細胞外基質蛋白等介導跨BBB轉運的配體上高表達[4]；而Angiopep-2是一種序列類似于LRP的新型多肽，其跨膜轉運效率明顯高于轉鐵蛋白(Tf)[5-6]，LRP-1受體在血管內皮細胞及膠質瘤中均有表達[7]，增加了Angiopep-2通過BBB轉運進入腦腫瘤。課題前期已合成經Angiopep-2修飾的納米對比劑，本研究主要從細胞和動物水平評估其在膠質瘤中的顯像價值，為腦膠質瘤的靶向性顯影提供新的研究方向。

1　資料與方法

1.1材料與儀器雙靶向納米聚合物(PDEA)-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG-co-FITC)(由本課題前期合成)；Angipep-2(強耀多肽公司)；C6細胞株(中科院生物化學與細胞生物學研究所)；紅細胞裂解液(碧云天生物制劑公司)；多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；小牛血清(杭州四季清公司)。熒光分光光度計F-4600(日本 Hitachi公司)；高分辨透射電子顯微鏡HRTEM(美國 FEI 公司)；1.5T HDx全身超導MRI(美國GE公司)。

1.2實驗動物SPF級雄性SD大鼠，體質量(265±15)g，由安徽省動物中心提供，購入后在 SPF級動物房喂養，光照/黑暗時間為12 h/12 h，環境溫度為25 ℃，適應性喂養1周后進行實驗操作。

1.3實驗方法

1.3.1弛豫率的測定將alkynyl-DOTA-Gd、CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)分別配成濃度為0、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 mmol·L-1，取2 mL裝入5 mL離心管內，1.5T MRI，柔性線圈，行自旋回波(spin echo,SE)T1WI掃描，回波時間(echo time,TE)固定為14 ms，重復時間(repetition time,TR)分別設為300、400、500、600、800、1 000 ms，采集MRI圖像，測定各濃度兩對比劑的信號強度，計算出各濃度的T1值，將1/T1對對比劑濃度作圖，直線的斜率為對比劑的弛豫度。

1.3.2細胞對納米聚合物的攝取率分別以每孔濃度2×105個C6、腦毛細血管內皮細胞(BCECs)細胞接種于細胞培養皿中。24 h后置換培養基，并分別加入50 mg·L-1ANG-NP-FITC，培養30 min、2、4 h。再將C6細胞分別與NP-FITC及ANG-NP-FITC培養15、30 min、1、2、4 h后，PBS洗3次，吸去培養液，PBS 洗滌3次，離心收集，配置細胞懸液，采用流式細胞儀分析熒光強度。

1.3.3膠質瘤腫瘤細胞球實驗及競爭性抑制實驗(1)體外膠質瘤腫瘤細胞球的建立：吸取加有瓊脂糖無血清的DMEM溶液單層平鋪于培養皿(直徑90 mm)，然后在每孔內加細胞濃度為2×103含有血清DMEM的細胞懸液，置于37 ℃、5%CO2的培養箱。培養第4天換液，后每2 d換液一次并觀察細胞球的生長狀況;(2)膠質瘤細胞球對雙靶向納米粒子的攝取率及競爭性試驗：將含有異硫氰酸熒光劑(FITC)標記的納米聚合物(200 mg·L-1)與膠質瘤腫瘤細胞球分別共培養30 min、4、24 h。用冷PBS清洗膠質瘤腫瘤細胞球4次，采用流式細胞儀測量熒光強度。競爭抑制實驗將上述C6腫瘤細胞球與1 mL的Angiopep-2 (200 mg·L-1)先培養60 min后重復上述操作。

1.3.4大鼠腦C6膠質瘤模型的建立采用大鼠腦內立體定向尾狀核區注射法建立C6腦膠質瘤模型[8]。

1.3.5雙靶向納米粒子在大鼠膠質瘤模型的顯影效果(1)將24只雄性成年SD大鼠隨機分為3組，每組8只。A組為注射標記Angiopep2-NP組，B組為非靶向NP組，C組為空白對照組;(2)于大鼠膠質瘤模型建立后第4天開始，每2 d進行一次MRI成像，直至B組全部動物均在T1WI上顯示強化的腫瘤;(3)10%水合氯醛麻醉大鼠，行三平面定位掃描后，分別行顱腦及腹部MR軸位及冠狀位T1WI、T2WI掃描；通過鼠尾靜脈A組注入Gd3+濃度為2 mg·kg-1的納米載體，B組注入2 mg·kg-1的Gd-DTPA組。分別于注入后即刻、10、20 min、1、4、12、24、48 h行軸位及冠狀位增強T1WI，掃描參數：矩陣256×192，FOV 8 cm×8 cm，層厚1 mm，間距0.5 mm。T1WI：FSE序列TR/TE = 300 ms/9.2 ms。T2WI：FSE序列，TR/TE = 2000 ms/126 ms。NEX = 4～6。測量平掃及增強后腫瘤實性部分、周圍正常組織的信號強度，背景信號的標準差，計算對比噪聲比(contrast noise ratio,CNR)。

1.4統計學方法采用SPSS16.0軟件對數據進行統計分析。使用配對樣本t檢驗或者兩獨立樣本t檢驗進行統計學分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1雙靶向納米對比劑的弛豫率測量不同TR值、不同濃度Gd3+時Angiopep2-雙靶向對比劑納米載體和Gd-DOTA對應的信號強度，用軟件計算出Gd-DOTA、CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)的縱向弛豫率分別為3.1及14.5 mmol·L-1·s-1(圖1、圖2)。

圖1　CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)和Gd-DOTA

圖2　CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)和Gd-DOTA縱向弛豫率曲線

2.2細胞攝取率在30 min、2、4 h，內皮細胞和C6細胞均攝取標有FITC的靶向對比劑；隨著時間延長，細胞的熒光強度逐漸增加(圖3)。ANG-NP-FITC熒光強度均明顯高于NP-FITC(圖4)。

注：A～C為標有FITC的Angiopep-2修飾的靶向對比劑與血管內皮細胞作用30 min、2、4 h后熒光效果；D～F為標有FITC的Angiopep-2修飾的靶向對比劑與C6細胞共培養30 min、2、4 h后的熒光效果。

圖3熒光顯像圖

注：C6細胞與濃度為300 mg·L-1標有FITC的CD-PDEA-P(OEGMA-co-GMA(N3))和CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)在不同時間共培養后的熒光強度變化曲線，ANG-NP-FITC組與NP-FITC組相比，P<0.05。

圖4各組不同時間共培養后的熒光強度變化曲線

2.3C6腫瘤細胞球攝取率及競爭抑制細胞培養24～48 h后，由5～60個細胞聚集而成的細胞團形成，但仍較疏松且存在游離的單個細胞。4 d后，細胞相互聚集呈球體，此時球體不易被吸管或其他器械沖散。隨著時間的延長，細胞球體積逐漸增大。流式細胞儀顯示4 h時熒光在C6細胞球邊緣聚集，隨著時間延長，膠質瘤細胞球中心靶向對比劑聚集明顯(圖5)。當C6細胞球與Angiopep-2先作用60 min再加Ang-NP-FITC后，熒光強度較前明顯減低。C6細胞分別與NP-FITC、Ang-NP-FITC及Angiopep-2+Ang-NP-FITC三組共培養24 h后熒光強度見圖6，ANG-NP組與Angiopep-2+ANG-NP組比較差異有統計學差異(P<0.05)。

注：A～C為ANG-NP-FITC與細胞球共培養30 min、4、24 h后熒光顯像；D～F為200 mg·L Angiopep-2先與C6細胞球培養60 min后，再加ANG-NP 30 min、4、24 h后熒光顯像。

圖5熒光顯像圖

注：ANG-NP組與Angiopep-2+ANG-NP組相比，*P<0.05。

圖6各組熒光強度對比圖

2.4MRI測量靶向對比劑對大鼠腦膠質瘤模型靶向強化效果

2.4.1腦膠質瘤MRI增強掃描的CNR腦內膠質瘤模型建立4 d后，行1.5T磁共振分別行T1WI、T2WI序列掃描后，在10 min左右出現輕度強化，12 h時CNR達最大值，24 h時CNR出現下降，48 h時CNR進一步減低(圖7)。

圖7　尾靜脈注射ANG-NP后不同時間的CNR值

2.4.2大鼠腦膠質瘤MRI增強掃描行Angiopep-2修飾的納米聚合物對比劑尾靜脈注射，10 min后腫瘤出現輕度強化，4 h時腫瘤輪廓顯示較前清晰，且隨時間延長強化越明顯，12 h時腫瘤呈明顯強化(圖8A)；在4 h左右門靜脈出現強化。而給予常規對比劑Gd-DTPA后腫瘤強化程度輕且輪廓顯示較差(圖8B)。

注：A為CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)注射后12 h時T1WI，腫瘤呈明顯強化，且邊界清晰；B為Gd-DTPA注射后10 min的T1WI，腫瘤邊緣輕度強化，邊界模糊。

圖8大鼠腦膠質瘤MR增強

3　討論

本課題使用的靶向納米聚合物對比劑中的Angiopep-2(TFFYGGSRGKRNNFKTEEY)是一種新型多肽，其相對分子質量為2.4×104，通過血管內皮細胞及膠質瘤細胞上均表達的LRP-1受體介導增加跨BBB轉運進入腦組織，因而得名雙級靶向[9]。Hobbs等[10]證實納米粒子直徑在200～1 200 nm之間時有滲透增強和滯留效應(enhanced permeability and retention，EPR)；而平均直徑接近100 nm的納米粒子具有更長的血液循環時間且單核細胞吞噬作用減低。本課題合成的靶向納米聚合物CD-PDEA-b-P(OEGMA-co-Gd-co-ANG)直徑約為130 nm。

本研究合成的靶向納米聚合物對比劑的弛豫率斜率明顯高于DOTA-Gd，這是由于納米合成聚合物對比劑體積大使其旋轉速率減慢，旋轉相關時間延長，因而水質子的弛豫速率得到顯著提高。Angiopep-2修飾的靶向納米聚合物在活體內的生物學分布情況與NPs表面修飾有關。一方面PDEA基團是親水性基團，納米聚合物能延長循環時間，增強納米聚合物EPR效應從而增加納米聚合物的被動靶向效應；另一方面Angiopep-2修飾后能進一步識別血管及膠質瘤細胞表面的LRP-1受體，介導受體-配體特異性結合靶向的轉運效應增加，導致腫瘤區域納米聚合物進入細胞內更多。

大量研究探索能通過BBB和膠質瘤的信號通路，發現LRP-1受體能在BBB和膠質瘤細胞上同時表達[4,11-12]。進一步研究發現Angiopep-2與LRP-1受體之間有高親和力[13-15]，因此本課題選用Angiopep-2作為穿透BBB和膠質瘤的配體。通過流式細胞儀直觀觀察C6細胞對靶向納米聚合物對比劑的攝取，發現C6細胞及血管內皮細胞與FITC標記的Angiopep-2修飾的靶向對比劑共培養2 h左右出現熒光效應，證明C6細胞及血管內皮細胞上均存在LRP-1受體；隨著時間延長，C6細胞與靶向對比劑作用組的熒光效應更明顯，表明隨時間延長，Angiopep-2修飾的靶向對比劑與LRP-1受體作用更多，因而腫瘤組織的顯影效果更好。所以，Angiopep-2修飾的靶向對比劑對膠質瘤的顯影有明顯改善。與文獻報道的結果一致[14,16]。

不同于單個細胞的培養，Zhang等[17]研究表明乏血供的腫瘤球能刺激局部實體瘤的乏血供區域，因而更接近實體瘤內局部缺氧、壞死區域缺血、低滲透效應的環境。Xin等[9]研究發現用羅丹明B異硫氰酸酯(RBITC)標記的ANG-PEG-NP組比RBITC標記的PEG-NP組在膠質瘤細胞球內的熒光效應更明顯，且RBITC標記的ANG-PEG-NP組在正常腦細胞中無明顯熒光表達，這與本研究結果相同。本研究采用C6膠質瘤細胞球模型來評估靶向對比劑穿透實體瘤的效率，結果顯示出非靶向對比劑在C6細胞球邊緣聚集，而經Angiopep-2修飾的靶向對比劑早期在細胞球邊緣聚集，且隨著時間延長，熒光效應明顯，且膠質瘤細胞球中心區也可見靶向對比劑聚集。表明經Angiopep-2修飾的靶向對比劑主要通過與腫瘤細胞表面LRP-1受體特異性結合而具有強穿透性，證明雖然膠質瘤實體腫瘤致密，但靶向對比劑仍能通過受體介導作用滲透入腫瘤的中心；同時證明了靶向對比劑應用于腫瘤的乏血供區域的價值。而將Angiopep-2先與C6細胞作用60 min后，再加入Ang-NP-FITC培養30 min、4 h、24 h后熒光強度明顯減低，與ANG-NP-FITC組熒光強度變化相比差異有統計學意義，說明Angiopep-2介導了靶向對比劑穿透C6腫瘤細胞球的效應，同時也證明了C6細胞球上存在LRP-1受體。比較NP-FITC、Ang-NP-FITC及Ang-NP-FITC+Angiopep-2組分別與C6細胞球作用24 h的熒光強度順序為：Ang-NP-FITC>NP-FITC>Ang-NP-FITC+Angiopep-2。表明預先經Angiopep-2作用后，前者與LRP-1受體結合飽和后，靶向對比劑無法再發揮作用。表明靶向對比劑主要通過與腫瘤細胞表面LRP-1受體特異性結合而具有強穿透效率，因而Angiopep-2作為膠質瘤靶向對比劑靶向性顯影的配體存在明顯優勢。

本研究中選取腦膠質瘤建模后第4 d行MRI檢查，注射靶向與非靶向對比劑后，靶向對比劑強化程度較DOTA-Gd明顯，在20 min時靶向對比劑出現強化，且隨時間延長，膠質瘤邊界較后者清晰，強化程度較后者明顯。注射Ang-NP-Gd后CNR在10 min時出現升高，隨時間延長CNR不斷增大，在12 h后出現高峰，24 h時減低，48 h后進一步減低。反映了經Angiopep-2修飾的靶向對比劑具有靶向作用于血管內皮細胞及腦腫瘤，能穿透血腦屏障，靶向性顯示腦膠質瘤，且能較清晰勾畫腫瘤的邊界。同時，CNR在24 h左右開始出現下降，說明靶向對比劑的代謝過程，也提供了進行增強掃描的時間段。

綜上所述，細胞和動物實驗表明，經Angiopep-2修飾的雙靶向納米聚合物對比劑通過與血管內皮細胞及膠質瘤細胞上的LRP-1受體結合，具有明顯的穿透效應，增強掃描具有良好的膠質瘤靶向性、且對腫瘤邊界的顯示清晰，這些發現能夠為膠質瘤的檢出和治療提供新的研究思路。

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Angiopep-2 mediated dual-targeting nanoparticle carrier and its value on magnetic resonance imaging of C6 glioma rat

ZHANG Jingjing,WANG Xiao,XU Yunxia,et al

(DepartmentofRadiology,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei,Anhui230022,China)

ObjectiveTo prepare Angiopep-2 mediated dual-targeting nanoparticle and to explore its targeting ability at cellular level and in animals.MethodsC6 cells and endothelial cells were incubated with Ang-NP-FITC and NP-FITC at different time,and the fluorescence intensity was assayed.The uptake of C6 glioma spheroids to Ang-NP and its competitive inhibition were observed with flow cytometry.Ang-NP-Gd or NP-Gd was respectively injected in rat C6 glioma model.The CNR of tumors were measured and compared between two groups,and the boundaries of tumors were compared.ResultsThe uptake of C6 cells and endothelial cells to Ang-NP-FITC was obvious.The order of fluorescence intensity of C6 glioma spheroids was Ang-NP-FITC,NP-FITC and Ang-NP-FITC+Angiopep-2 in descending order.With Ang-NP-Gd enhancement,the boundary of tumors was clearer.CNR was increased by time and reached the top at 12 h.ConclusionsAngiopep-2 combined with LDL receptor related protein-1 receptor of vascular endothelial cell and glioma cell,which has very strong ability to penetrate the BBB and enter the brain glioma.

Magnetic resonance imaging/methods;Nanoconjugates;Glioma;Molecular targeted therapy;Rats,sprague-dawley

安徽省自然科學基金(No 1308085MH166)

錢銀鋒，男，副教授，碩士生導師，研究方向：中樞神經系統影像診斷， E-mail：894206876@qq.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.008

2016-04-17，

2016-06-20)