葛根素注射液對糖尿病家兔溶血作用研究

曹燁君，丁選勝

(1.常州市第四人民醫院臨床藥學室,江蘇 常州　213001；2.中國藥科大學臨床藥學教研室,江蘇 南京　 210009)

?

葛根素注射液對糖尿病家兔溶血作用研究

曹燁君1，丁選勝2

(1.常州市第四人民醫院臨床藥學室,江蘇 常州213001；2.中國藥科大學臨床藥學教研室,江蘇 南京 210009)

目的研究葛根素注射液在正常和糖尿病家兔體內給藥后的溶血規律，為臨床安全合理用藥提供依據。方法采用四氧嘧啶復制1型糖尿病家兔模型，并與正常健康家兔進行對照，設置10、20、40 mg·kg-1體質量三個劑量組，每周期給藥10 d，在給藥前以及每個給藥周期的第2、4、6、8、10天分別采血，觀察紅細胞形態并比較體外溶血差異。結果正常家兔和糖尿病家兔紅細胞在給藥后的溶血率較之給藥前均有升高，糖尿病組的溶血率高于正常組，在給藥后6～8 d溶血率升至最高。溶血率與給藥劑量和給藥時間成正相關。結論臨床使用葛根素注射液，給藥時間應控制在8 d以內，若需長時間用藥，需要在每個用藥周期后間隔4～5 d的清洗期，以保證用藥安全性，避免發生溶血反應。

葛根素/副作用;溶血;糖尿病,實驗性;兔

葛根素注射液是臨床常用藥物之一，臨床上也發現其存在諸多不良反應，其中比較嚴重的是溶血性反應[1-4]，往往會導致患者死亡等嚴重后果。目前，針對藥物溶血反應，主要采用健康正常動物紅細胞體外溶血進行評價，少見采用病理狀態下動物體內給藥，研究藥物溶血反應。糖尿病及其并發癥作為葛根素注射液的主要適應證之一，其主要患病人群為中老年人，正是葛根素注射液不良反應發生的高風險人群。在糖尿病病程中，紅細胞會發生一系列的病理改變，如紅細胞內黏度增加，聚集性增強，最終血液黏度增高，流動性降低，紅細胞變形能力下降。同時糖尿病患者的紅細胞脂質過氧化會導致紅細胞形態和功能的損傷，可能會增加溶血發生的概率。在糖尿病患者中，尚缺乏藥源性溶血研究。糖尿病作為一種全身性質的疾病，在進展過程中對于各個系統及器官都有顯著的影響。因此，選用糖尿病動物模型[5]來觀察葛根素注射液給藥后溶血反應更符合臨床實際,可以更全面地分析葛根素對于紅細胞的作用[6]。本課題就葛根素注射液在正常和糖尿病家兔體內給藥后的溶血規律加以研究，為臨床安全合理用藥提供依據。

1　實驗方法[7-10]

1.1實驗動物及藥品健康家兔36只，普通級，雌雄各半，由江蘇省南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，生產許可證號：SCXK(蘇)2013-0008。葛根素注射液：青島金峰制藥有限公司，規格：200 mg/4 mL,批號130810。

1.2糖尿病家兔模型復制用氯化鈉注射液配置5%四氧嘧啶溶液，家兔禁食12 h后按照130 mg·kg-1一次性耳緣靜脈注射四氧嘧啶溶液，注射后立即喂食并補充葡萄糖溶液，防止低血糖的發生。72 h后測定空腹血糖，2次血糖值>16.7 mmol·L-1時認為糖尿病模型建立。

1.3家兔給藥方法正常及糖尿病家兔各分為3個劑量組，每組6只，經耳緣靜脈，每日根據體質量按照10、20、40 mg·kg-1分為低、中、高劑量組給藥。正常及糖尿病組家兔均分為1個給藥周期，每周期10 d。給藥前及每周期第2、4、6、8、10天給藥后24 h采血。

1.4采血及血樣處理家兔耳中動脈采血4 mL，新鮮血液加入肝素(0.5 g·L-1血液)抗凝。抗凝血3 000 r·min-1離心10 min，取上層清液即為血漿，-20 ℃保存備用；下層紅細胞用8～10倍生理鹽水洗滌2～3次，1 500 r·min-1離心15 min，至上層清液無色透明，離心后棄上層液，按所得紅細胞體積加入生理鹽水配置5%紅細胞懸液，搖勻，4 ℃保存備用。

1.5家兔紅細胞與葛根素注射液體外溶血實驗取玻璃試管10支，編號，按照表1所示加樣，其中1～8號管為樣品管，9號為陰性對照管，10號為陽性對照管。各管依次加入葛根素注射液、0.9%生理鹽水或蒸餾水，最后加入5%紅細胞懸液，試管內葛根素終濃度為0.4、0.8、2、4、6、8、10、12 g·L-1。各試管搖勻后于37 ℃孵育3、6 h，孵育結束后1 500 r·min-1離心15 min，于545 nm處，1 cm光徑測吸光度，并按照以下公式計算溶血率：溶血率(%)=(OD待測-OD陰性)/(OD陽性-OD陰性)×100%。

2　實驗結果

2.1低劑量葛根素注射液給藥后家兔體外溶血規律

2.1.1正常家兔低劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規律正常家兔紅細胞與不同濃度葛根素注射液體外孵育后溶血率結果顯示，在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1的范圍內，隨著葛根素濃度升高溶血率逐漸增大；而在葛根素終濃度為4～12 g·L-1范圍內，隨著葛根素濃度升高溶血率有所下降。在給藥周期中，隨著給藥時間的延長，各濃度點的溶血率較之未給藥組均有所升高，在給藥第6天溶血率達到最大值。體外孵育3 h時，給藥6 d的溶血率在葛根素終濃度為0.4、0.8、6、8、10、12 g·L-1的溶血率與未給藥及給藥4 d相比差異有統計學意義。體外孵育6 h，給藥6 d時紅細胞的體外溶血率高于其他天數給藥組，與未給藥組在葛根素終濃度為2、6、8、10、12 g·L-1差異有統計學意義。可見在給藥6 d時，溶血率較之其他時間有明顯增高,見表2，3。

2.1.2糖尿病家兔低劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規律糖尿病組家兔紅細胞與不同濃度葛根素注射液體外孵育后溶血率結果顯示，在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1范圍，溶血率逐漸升高；在葛根素終濃度為4～12 g·L-1范圍內，溶血率先下降后略升高。低劑量葛根素注射液給藥后，糖尿病家兔紅細胞體外溶血率在各個時間點及濃度點較正常家兔有所升高，但大部分差異無統計學意義，在給藥第4天時，各濃度點的溶血率較其他天數有所增大，在給藥4 d后溶血率較之前略降低。孵育6 h的溶血率高于孵育3 h，溶血率隨給藥時間延長而升高，第4天達到最大值，之后逐漸降低。體外孵育6 h的溶血曲線與3 h相比略有不同，在給藥第6天和第8天時，葛根素終濃度為8 g·L-1的溶血率略升高。見表4，5。

表1　葛根素注射液體外溶血實驗加樣表/mL

表2　低劑量組不同給藥時間正常家兔紅細胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表3　低劑量組不同給藥時間正常家兔紅細胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表4　低劑量組不同給藥時間糖尿病家兔紅細胞孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

2.2中劑量葛根素注射液給藥后家兔體外溶血規律

2.2.1正常家兔中劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規律中劑量葛根素注射液給藥后，正常家兔紅細胞與不同濃度葛根素體外孵育后，溶血率高于低劑量組給藥的溶血率。隨著給藥天數的延長，紅細胞體外孵育3 h的溶血率逐漸升高，在給藥第8天時達到最大值，而后略有下降。孵育6 h的溶血率在第2天和第4天時有所增高，后逐漸下降，但仍高于未給藥組。在孵育6 h時，第4天和第6天溶血曲線的最高點出現在2 g·L-1的葛根素終濃度點上，曲線的走勢略有不同。 見表6,7。

表5　低劑量組不同給藥時間糖尿病家兔紅細胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表6　中劑量組不同給藥時間正常家兔紅細胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表7　中劑量組不同給藥時間正常家兔紅細胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

2.2.2糖尿病家兔中劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規律糖尿病家兔紅細胞體外溶血率在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1范圍內隨濃度升高而增大；而在4～12 g·L-1濃度范圍內，溶血率先逐漸降低而后又略微升高。在中劑量葛根素注射液給藥后，糖尿病家兔紅細胞體外孵育3 h溶血率隨時間延長而逐漸升高，給藥6 d后達到最大值，之后略微下降，但仍高于給藥前。體外孵育6 h溶血率高于孵育3 h組，且隨給藥時間延長溶血率升高，在第6天達到最大值，之后略微下降。見表8,9。

2.3高劑量葛根素注射液給藥后家兔體外溶血規律

2.3.1正常家兔高劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規律正常家兔紅細胞與不同濃度葛根素注射液體外孵育3 h，在葛根素終濃度為0.4～4 g·L-1范圍內，隨葛根素濃度升高溶血率逐漸增大；而在葛根素終濃度為4～12 g·L-1范圍內，溶血率隨濃度升高而降低。體外孵育6 h，溶血曲線與3 h相比略有不同，在葛根素終濃度為0.4～2 g·L-1范圍內，溶血率隨葛根素濃度升高而增大；而在葛根素終濃度為2～12 g·L-1范圍內，溶血率隨濃度升高而降低。高劑量葛根素注射液給藥1周期后，體外孵育3 h各濃度點溶血率隨著給藥天數延長而升高，在第6天達到最大值，隨后略有下降。體外孵育6 h的溶血率較之孵育3 h有明顯升高，給藥后溶血率隨給藥天數延長而升高，同樣在第6天達到最大值，隨后有所降低。低濃度范圍內，體外孵育6 h各時間點的溶血率與未給藥時相比差異有統計學意義。見表10,11。

2.3.2糖尿病家兔高劑量葛根素注射液給藥后體外溶血規律糖尿病家兔紅細胞體外溶血率整體高于正常家兔紅細胞。在高劑量葛根素注射液第1給藥周期，家兔紅細胞體外孵育3 h各濃度點的溶血率隨給藥時間的延長而升高，給藥第8天達到最大值，之后略有降低。

糖尿病家兔紅細胞體外孵育6 h，溶血率在葛根素終濃度為4 g·L-1達到最大值，各濃度點的溶血率同樣隨給藥時間的延長而增加，在第6天時達到最大值，之后略有降低。給藥早期，高濃度葛根素(6～12 g·L-1)的溶血率較之正常高劑量組差異有統計學意義。見表12,13。

表8　中劑量組不同給藥時間糖尿病家兔紅細胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

表9　中劑量不同給藥時間糖尿病家兔紅細胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

表10　高劑量組不同給藥時間正常家兔紅細胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表11　高劑量組不同給藥時間正常家兔紅細胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

表12　高劑量組不同給藥時間糖病家兔紅細胞體外孵育3 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05。

3　討論

家兔靜脈注射給予葛根素注射液后，會在一定程度上引起紅細胞的損傷，主要表現為家兔紅細胞體外溶血實驗中溶血率的增大，以及紅細胞形態的變化(出現皺縮、破裂、大小不均一)。不同劑量葛根素注射液都會引起家兔紅細胞體外溶血率的增大，且增大的趨勢與劑量成正相關性。同時，溶血率的變化與給藥天數相關，在給藥6～8 d后，溶血率出現峰值，隨后緩慢恢復。有研究結果表明，葛根素注射液體內給藥后，會導致免疫性溶血的發生，在連續給藥的過程中，體內的抗體逐漸累積，在給藥第8天時呈現最大值。葛根素作為小分子的半抗原，在進入體內后與體內的大分子結合形成抗原，進而結合在紅細胞表面上，形成免疫復合物，改變紅細胞的表面結構，致使紅細胞更易發生破裂。

表13　高劑量組不同給藥時間糖尿病家兔紅細胞體外孵育6 h溶血率±s)

注：與0.4 g·L-1濃度組比較aP<0.05；與0 d比較bP<0.05。

糖尿病家兔紅細胞體外溶血率較之正常家兔有所升高，在葛根素注射液給藥后溶血率的變化趨勢與正常家兔類似。由于糖尿病家兔的紅細胞在體內高糖環境下變形指數下降，紅細胞的剛性指數上升，血液流變學指標增大，紅細胞膜上膜蛋白表達改變，脂質過氧化，膽固醇/磷脂比例的改變，同時還伴隨有Na+/K+-ATPase的活性改變[11-12]，這些因素都影響著紅細胞的結構功能。因此，糖尿病家兔的紅細胞較之正常家兔紅細胞對于藥物作用更加敏感，直接表現為體外溶血率的升高。同時，葛根素在糖尿病家兔體內的藥代動力學較之正常家兔有顯著的變化，藥物清除速率降低，在體內蓄積的藥物濃度增大，體內紅細胞處在一個相對較高的葛根素濃度中，葛根素對其的作用更加顯著，紅細胞的損傷疊加，體外溶血率升高。

由于臨床用藥中患者處于病理狀態，紅細胞的各項功能都有所改變，采用糖尿病模型動物紅細胞研究葛根素注射液的體外溶血作用更加符合臨床實際。實驗結果表明，在糖尿病狀態下，紅細胞的體外溶血率較之正常狀態有顯著升高，但整體的溶血率變化趨勢與正常家兔相同。在糖尿病狀態下，紅細胞的剛性指數、變形能力以及紅細胞脆性等指標較之正常狀態有了顯著的變化，導致紅細胞在藥物作用下更容易破裂，導致溶血反應。

綜上所述，在臨床用藥過程中，要注意在給藥6～8 d后患者的基本狀況，若出現肌肉酸痛、腰痛、尿潛血等狀況時，應考慮葛根素導致溶血的可能。同時應注意藥物的用量，在藥品說明書規定范圍內合理用藥。若需長時間用藥，要分周期給藥，每個給藥周期間間隔4～5 d作為清洗期，避免長時間連續用藥導致藥物不良反應發生。

[1]蘇玉成.葛根素注射劑不良反應87例分析[J].中國醫療前沿,2012,7(19):68-69.

[2]侯少貞,李耿,梁穎敏,等.葛根素注射液體外溶血的實驗研究[J].中藥新藥與臨床藥理，2011，22(3):289-291.

[3]王凡,何明.葛根素注射液不良反應的相關研究[J].內蒙古中醫藥,2011,30(23):72,92.

[4]Chen F,Liu S,Wu J.Puerarin-induced immune hemolytic anemia[J].International Journal of Hematology,2013,98(1):112-113.

[5]易月娥,聶彥娜,李姝玉,等.葛根素注射液對糖尿病KKAy小鼠腎小管上皮細胞的影響[J].中國病理生理雜志,2013,29(12):2263-2267.

[6]Hou SZ,Su ZR,Chen SX,et al.Role of the interaction between puerarin and the erythrocyte membrane in puerarin-induced hemolysis[J].Chemico-biological Interactions，2011,192(3):184-192.

[7]黃敏娟,賀煜星,丁選勝.不同輸液配伍葛根素注射液對溶血的影響[J].中國醫院藥學雜志，2015,35(5):425-429.

[8]原歡歡,張繼芬,王琴,等.梓葛凍干粉針的局部刺激性、過敏性、溶血性和急性毒性研究[J].中國藥理學通報,2013,29(6):880-881.

[9]邵磊,李昇剛,孫振平,等.葛根素注射液對豚鼠紅細胞溶血率的影響及溶血機制探討[J].中國藥師,2012,15(7):945-947.

[10] 賀煜星,丁選勝.吐溫80體外溶血研究[J].安徽醫藥,2014,18(3):444-446.

[11] 劉新正,劉紅麗,涂學亮.243例糖尿病患者血液流變學檢測指標分析[J].檢驗醫學與臨床，2010,7(20):2213-2215.

[12] 雍軍光,阮萍,馮博華,等.糖尿病腎病患者紅細胞形態功能變化與病程發展的關聯性研究[J].暨南大學學報(自然科學與醫學版),2013,34(6):610-614.

Hemolytic effect of puerarin injection on normal and diabetic rabbits

CAO Yejun1,DING Xuansheng2

(1.No.4HospitalofChangzhou,Changzhou,Jiangsu213001,China;2.DepartmentofClinicalPharmacy,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing,Jiangsu210009,China)

ObjectiveTo study the rule of puerarin injection hemolysis on normal and diabetic rabbits,and provide evidence for clinical rational administration of drug.MethodsThis study established type 1 diabetic rabbits model by alloxan,comparing to healthy rabbits.The dosages of treatment were 10,20,40 mg·kg-1,respectively.The treatment of healthy and diabetic rabbits was divided into 2 periods.Every period had 10 days.Before and during the treatment blood was collected for observation of red cell morphology and comparison of in vitro hemolysis.ResultsThe study showed that after treatment,the hemolysis rate increased in healthy and diabetic rabbits.In 6～8 d,the hemolysis rate reached highest in diabetic rabbits,which was higher than healthy rabbits.The hemolysis rate had a positive correlation with dosage and time.ConclusionsIn clinical practice,the treatment should be controlled within 8 days.If the patients need a long time of treatment,it must be divided into several periods,which has 4 to 5 days as an interval.That would ensure drug safety and avoid hemolytic reaction.

Puerarin/adverse effects;Hemolysis;Diabetes mellitus,experimental;Rabbits

國家自然科學基金(81073145)

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.004

2016-03-08，

2016-06-15)