替格瑞洛原料中甲酸含量的檢查

黃滔+李合+金鑫

[摘要]目的運用高效液相色譜法測定替格瑞洛原料藥中甲酸的含量。方法采用Welch Ultimate AQ-Cls色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以pH=2.5磷酸緩沖液及乙腈為流動相，進行梯度洗脫；流速1.0mL/min；檢測波長210nm；柱溫30℃。結果甲酸在10.06～70.39μg/mL濃度范圍內，濃度和峰面積線性關系良好，線性方程：Y=2.88×10X（過原點），r=0.9957；回收率平均值為98.7%，RSD為0.73%。結論該方法可行，對替格瑞洛原料的質量控制有一定的意義。

[關鍵詞]高效液相色譜法；梯度洗脫；替格瑞洛；甲酸

替格瑞洛是首個可逆的結合型P2Y12腺苷二磷酸受體（ADP）拮抗劑，能可逆性地作用于血管平滑肌細胞上的嘌呤2受體亞型P2Y12，對ADP引起的血小板聚集有明顯的抑制作用，能有效改善急性冠心病患者的癥狀，已被證明比Plavix更有效，是第一個證實能減少急性冠脈綜合征所有類型的心血管死亡的抗血小板藥物。我司的替格瑞洛合成工藝中使用了甲酸溶劑。甲酸為第三類溶劑，根據藥典要求，需限制使用，中國藥典規定其限度為0.5%。為保證我司替格瑞洛的產品質量，建立了液相分析方法對殘留的甲酸含量進行檢測，并對該方法進行了方法學驗證，確保檢測結果的準確可靠。

1儀器與試藥

Dionex UltiMate 3000高效液相色譜儀；Chromeleon 7工作站；德國賽多利斯BP211D型電子天平。

替格瑞洛樣品（珠海保稅區麗珠合成制藥有限公司，批號為1403001、1403002、1404001）；甲酸對照品（色譜純，Fisher）；注射用水；磷酸二氫鈉（分析純，廣州化學試劑二廠）；磷酸（分析純，廣州化學試劑廠）。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱為Welch Ultimate AQ-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫為30℃；流動相A為磷酸緩沖液（50mmol/L的磷酸二氫鈉，磷酸調pH值至2.5）；流動相B為乙腈；流速為1.0mL/min；檢測波長為210mm；進樣量為5μL，按表1采用梯度方式進行洗脫。

2.2溶液制備

取甲酸適量，精密稱定，加20%乙腈溶解并定量稀釋成每1mL約含50μg甲酸的溶液，加20%乙腈定容至刻度，即得對照品溶液（約50μg/mL）。取本品250mg，精密稱定，置量瓶中，加乙腈5mL，50℃水浴使完全溶解，放冷，加水定容至刻度，搖勻，離心，上清液過濾，即得供試品溶液。

2.3方法學考察

2.3.1色譜柱及檢測波長的選擇甲酸屬大極性的小分子有機物，在常規的c₁₈色譜柱上較難保留，研究過程中嘗試了常規C₁₈色譜柱、HILIC親水色譜柱和AQ-C₁₈。色譜柱，結果顯示，AQ-C₁₈色譜柱對于甲酸有較好的保留且峰形良好，故采用AQ-C₁₈色譜柱進行研究。參考相關文獻資料，采用210nm的波長進行考察。

2.3.2線性關系的考察取甲酸對照品適量，精密稱定，加20%乙腈溶解并定量稀釋成每1mL約含0.1mg的溶液，作為對照品儲備液。分別精密量取1、2、3、4、5、6、7mL，置10mL量瓶中，加20%乙腈定容至刻度，作為不同濃度的線性供試液（約相當于甲酸限度濃度的20%～140%）。分別精密量取5μL，按“1.2.1項”色譜條件，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標，以溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，進行線性回歸（過原點），回歸方程為Y=2.88×10^-4x，r=0.9957，結果表明，甲酸在10.06～70.39μg/mL濃度范圍內，濃度與峰面積的線性良好。

2.3.3精密度試驗系統精密度。精密量取甲酸對照品溶液5μL，重復進樣6次，甲酸峰面積RSD為1.13%。

重復性試驗。平行制備6份替格瑞洛供試品溶液，分別精密量取供試品溶液和甲酸對照品溶液各5μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算各樣品中的甲酸含量，檢驗結果顯示，6份供試品溶液均未檢出甲酸。

2.3.4溶液穩定性試驗將樣品與甲酸混合，在室溫條件下放置，于0、2、4、6、8h取樣，以甲酸峰面積計算，RSD值為1.12%，表明樣品溶液在室溫條件下8h內穩定。

2.3.5準確度試驗取甲酸對照品適量，精密稱定，加乙腈溶解制成含甲酸為2.5mg/mL的溶液，作為對照品儲備液；分別取對照品儲備液4、5、6mL，置50mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成甲酸濃度分別為0.20、0.25和0.30mg/mL的乙腈溶液，作為標準加入液。另取甲酸對照品適量，精密稱定，用20%乙腈制成甲酸濃度約為50μg/mL的溶液，作為對照品溶液。取替格瑞洛樣品0.25g，置25mL量瓶中，平行9份，分為三組，分別加入三個濃度的標準加入液5mL，50℃超聲使完全溶解，放冷，加水定容至刻度，搖勻，離心，上清液0.45μm濾過，取續濾液作為供試品溶液，分別制成高、中、低3個濃度的供試品溶液，每個濃度下測試3次，計算甲酸的平均回收率（n=9）為98.7%，RSD=0.73%，結果見表2。

2.3.6檢測限和定量限取甲酸對照品溶液用流動相逐級稀釋，進樣分析，按S/N=3（噪音高度的3倍）計算檢測限；按S/N=10（噪音高度的10倍）計算定量限。結果甲酸的檢測限為1.40μg/mL；定量限為4.66μg/mL。

2.4樣品測定

取不同批次的替格瑞洛樣品共3批，測定甲酸的含量，結果見表3。

3討論

甲酸無色而有刺激氣味，且有腐蝕性，人類皮膚接觸后會起泡紅腫，同時具有酸和醛的性質，是基本有機化工原料之一，廣泛用于農藥、皮革、染料、醫藥和橡膠等工業。在有機合成中用于合成各種甲酸酯、吖啶類染料和甲酰胺系列醫藥中間體。甲酸的急性毒性LD50：1100 mg/kg（大鼠經口）；亞急性和慢性毒性：小鼠飲水中含0.01%～0.25%游離甲酸，2～4個月內無任何影響；含0.5%則影響食欲并使其生長緩慢。2015版《中國藥典》通則0800限量檢查法中附表1藥品中常見的殘留溶劑及限度中指出，甲酸屬于第三類溶劑（藥品GMP或其他質量要求限制使用），規定限度應≤0.5%。為了更好地控制產品質量，需對替格瑞洛原料合成過程中使用倒的甲酸殘留進行定量控制。在常規檢測中，甲酸含量測定多采用氣相色譜法，由于氣相方法需要進行衍生化，衍生化程度較難控制，由于甲酸在210nm下具有較強的紫外吸收，且HPLC的靈敏度較高，達到檢測要求，故采用操作簡易的HPLC法。

在本實驗中，通過較全面的方法學驗證，建立了一種梯度反相HPLC測定法，并對該方法進行方法學驗證，驗證結果表明，甲酸在10.06～70.39μg/mL濃度范圍內，線性良好；三個濃度平均回收率為98.7%，RSD為0.73%，方法準確度良好；系統精密度、重復性試驗結果良好；在室溫條件下放置，8h內溶液穩定性良好；檢測限為1.40μg/mL，定量限為4.66μg/mL。在該色譜系統中，甲酸色譜峰保留時間適宜，峰形良好，重現性好，靈敏度高可準確可靠地測定替格瑞洛原料藥中甲酸殘留含量。