諾如病毒鎮(zhèn)江株全基因組序列測(cè)定與分析

侯 莉瞿 韋傅行禮高 放沈 權(quán)彭蘡芮志蓮

諾如病毒鎮(zhèn)江株全基因組序列測(cè)定與分析

侯 莉1瞿 韋1傅行禮2高 放1沈 權(quán)2彭蘡3芮志蓮3

諾如病毒有高度變異性，序列分析對(duì)監(jiān)測(cè)病毒變異具有重要意義，而其全基因組序列依然有限，有鑒于此，本研究采用病毒宏基因組方法對(duì)鎮(zhèn)江一株諾如病毒進(jìn)行了全基因組克隆與分析。結(jié)果顯示，除去5’非編碼區(qū)和3’poly（A）結(jié)構(gòu)，NOV/CHN/ZJ01毒株全長(zhǎng)7 509 bp，含有3個(gè)開(kāi)放式閱讀框（ORFs）。序列分析顯示，本毒株與一株日本人諾如毒株（AB972502）同源性最高，為99%。基于外殼蛋白和RdRp核酸序列進(jìn)化分析表明，NOV/CHN/ZJ01毒株與日本毒株AB972502同屬GII-4，然而，他們與其他毒株在GII-4里形成3個(gè)不同的Cluster。這表明，本毒株與這株日本毒株具有相同的進(jìn)化起源。應(yīng)加大對(duì)諾如病毒的監(jiān)測(cè)力度，避免新的流行。

諾如病毒；病毒宏基因組；全基因組

諾如病毒（Norovirus，NoVs）屬杯狀病毒科［1］，無(wú)包膜病毒。基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約7.7 kb，由3個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading Frames，ORFs）組成，并在3'端含有一個(gè)多聚A結(jié)構(gòu)［2］。ORF1編碼一個(gè)大的多聚蛋白，經(jīng)蛋白酶水解后生成成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白，其中包括RNA 聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp），ORF2編碼主要的外殼蛋白VP1，和ORF3編碼小的外殼蛋白VP2［3］。VP1上有兩個(gè)主要區(qū)，外環(huán)區(qū)（shell domain，S區(qū)）和突起臂區(qū)（protruding arm，P區(qū)）［4］。

諾如病毒基因組高度變異，根據(jù)其RdRp和衣殼蛋白核苷酸序列差異，被分為5個(gè)基因群（Genogroup，GI-V）和至少45個(gè)基因型（Genogroup）［5］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)23株毒株的RdRp和衣殼蛋白基因分屬于不同基因型，并且確定重組的斷點(diǎn)（Breakpiont）一般位于ORF1/ORF2重疊區(qū)［3］。GII.4毒株有較高的突變效率［6］。此文對(duì)鎮(zhèn)江地區(qū)一株諾如病毒全基因組（NVCHN/ZJ01）分析序列并與GII2.4群流行株進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

本研究的3例糞便標(biāo)本于2015年7～10月采自江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院門診，患者為71～85歲老年男性急性腸胃炎患者。采用病毒宏基因組方法分析樣本中病毒組成。文庫(kù)構(gòu)建操作按照Nextera XT DNA Sample Preparation Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（Illumina）。深度測(cè)序由Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。生物信息學(xué)分析參見(jiàn)Zhang等［7］。

序列拼接采用Geneious（4.8.2）軟件。將拼接序列應(yīng)用BLAST軟件在GenBank同源性比對(duì)；應(yīng)用Clustal X軟件（1.8）進(jìn)行序列的多重比對(duì)和分析；應(yīng)用MEGA 6軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。用于系統(tǒng)進(jìn)化分析的諾如參考株來(lái)自于GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果與分析

3份糞便樣本中有1份諾如病毒陽(yáng)性。經(jīng)病毒宏基因組測(cè)序與拼接后，除去5’非編碼區(qū)和3’poly（A）結(jié)構(gòu)，NOV/ CHN/ZJ01毒株全長(zhǎng)7 509 bp，含有3個(gè)開(kāi)放式閱讀框（ORFs）（表1）。ORF1長(zhǎng)5 100 bp，ORF2為1 623 bp，而ORF3為807 bp。基于全基因組的序列分析顯示，本毒株與一株日本人諾如毒株（AB972502）同源性最高，為99%。與其在ORF1、ORF2和ORF3序列上同源性最高的毒株分別是日本毒株AB972502、香港毒株KM268106和北京毒株KJ716363，同源性均為99%。上述3個(gè)毒株均為GII.4毒株。

表1 本研究NoV及參考毒株的基因組結(jié)果

圖1 基于外殼蛋白（B）核酸序列構(gòu)建的進(jìn)化分析結(jié)果

基于外殼蛋白全序列的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示，NOV/CHN/ ZJ01毒株與日本毒株AB972502聚在一起，核酸同源性為99%（圖1）。NOV/CHN/ZJ01毒株與日本毒株AB972502同為GII-4，然而，他們與其他毒株在GII-4里形成3個(gè)不同的Cluster。基于RdRp 區(qū)C-末端260個(gè)氨基酸的進(jìn)化分析表明，NOV/CHN/ZJ01毒株在進(jìn)化分類與外殼蛋白的進(jìn)化分析相同（圖2），與AB972502毒株聚在一起同為GII-4下的一個(gè)分支，這也表明本毒株不是重組毒株。

諾如病毒高度變異，GII-4群毒株是流行的優(yōu)勢(shì)株［8］。本研究發(fā)現(xiàn)的鎮(zhèn)江毒株在系統(tǒng)進(jìn)化上也屬于GII-4。基于全序列的同源性分析顯示，本毒株與一株日本毒株同源性最高，達(dá)99%，這表明這兩個(gè)毒株具有相同的進(jìn)化起源［7］。提示，衛(wèi)生防疫部門應(yīng)該加大對(duì)諾如病毒的監(jiān)測(cè)力度，防范諾如病毒新的流行毒株的出現(xiàn)。

圖2 基于RNA依賴的RNA聚合酶（核酸序列構(gòu)建的進(jìn)化分析結(jié)果）

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The Genomic Sequence Analysis of Human Norovirus Strain in Zhenjiang

HOU Li1ZHAI Wei1FU Xingli2GAO Fang1SHEN Quan2PENG Ying3RUI Zhilian31 Department of Geriatrics，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212000，China，2 School of Medicine in Jiangsu Univerisity，Zhenjiang Jiangsu 212000，China，3 Clinical Laboratory，People's Hospital of Liyang，Liyang Jiangsu 213300，China

【Abstract】

Noroviruses（NoV）is highly variable，sequence analysis has an important significance to the monitoring of viral variation，and the whole genome is still limited. In view of this this study using viral metagenomic methods of zhenjiang strain noroviruses were genome cloning and analysis. In the present study，the full-length genomes of human NoV from zhenjiang was determined and the genomic organization was analyzed by metagenomic method. This strain is 7 509 bp in length and had similar genome organization and contained three predicted ORFs with other GII stains. Phylogenetic analysis showed that this strain was divided into GII-4 and clustered with a japanese strian. They shared 99% identity in full length. This results showed that this two strains had the same orgination.

Norovirus，Genome，Metagenomic

R446

A

1674-9316（2016）15-0150-03

10.3969/j.issn.1674-9316.2016.15.088

常州市社會(huì)發(fā)展項(xiàng)目（編號(hào)：CY20130026）

1 江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院老年科，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；2 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212000；3 溧陽(yáng)市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 溧陽(yáng) 213300