聊城地區黃瓜靶斑病致病菌的鑒定與形態觀察

馬迪 王桂清

摘要：近年來聊城地區保護地黃瓜多發靶斑病。對病樣進行分離、致病性測定、培養性狀觀察、形態學鑒定，尤其對孢子形態進行了詳細的顯微觀察。結果表明，引起聊城地區黃瓜靶斑癥狀的病原菌為多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）。該菌在PDA培養基上菌落圓形，白色至淺灰褐色，平鋪，質地致密，輻射狀展開，邊緣規則；菌絲淡褐色或灰黑色，具分枝和隔膜；分生孢子梗直或彎曲，淺褐色，不分枝，有分隔；分生孢子頂生，多單生，淺褐色，倒棍棒形或圓筒形，直或稍彎曲，壁光滑，具1個至多個隔膜，孢子長度為34.42～316.92 μm，寬度為11.45～22.45 μm。

關鍵詞：黃瓜；靶斑病；致病菌；形態特征；多主棒孢霉

中圖分類號：S436.421 文獻標識碼：A 文章編號：1674-1161（2016）06-0011-03

黃瓜靶斑病，又名褐斑病、棒孢葉斑病等，俗稱“黃點病”，是近年來侵入設施黃瓜危害嚴重的一種病害，全國各地設施黃瓜均有發生。該病害嚴重影響植株光合作用[1]，使黃瓜產量減少、品質下降。20世紀60年代初，戚佩坤等人報道Corynespora cassiicola可侵染黃瓜，主要為害葉片[2]。在寄主黃瓜上，其癥狀與霜霉病和細菌性角斑病的發病癥狀相似，很難區分，以至于誤用藥劑防治，帶來了嚴重后果，損失巨大。黃瓜靶斑病與細菌性角斑病的區別在于，前者病斑葉兩面色澤相近，濕度大時上生灰黑色霉狀物；而后者葉背面有白色菌膿形成的白痕，清晰可辨，兩面均無霉層。黃瓜靶斑病與霜霉病的區別在于，靶斑病病斑枯死，病健交界處明顯，病斑粗糙不平；而霜霉病病斑葉片正面褪綠、發黃，病健交界處不清晰，病斑很平。近年來，這3種病害在聊城地區保護地黃瓜上混合發生。為了明確引起圓形或不規則形、中央具一明顯靶心癥狀的病害類型和致病菌種類，于2015年早春采集病樣，對病原進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與癥狀觀察

2015年3月，于聊城市東昌府區莊行鎮大棚栽培的有刺黃瓜葉片上采集類似靶斑病癥狀的葉片，記錄癥狀，拍攝照片，制作標本。

1.2 病原菌的分離與純化

以PDA培養基作為基本培養基，采用組織分離法對病斑進行分離，采用單孢分離法對分離菌進行純化。以3%次氯酸鈉作為表面消毒液，消毒時間3～5 min。分離和擴繁采用PDA平板，于25±1 ℃的恒溫培養箱（玻璃門，自然光照）中培養4～7 d；純化菌株保存采用PDA斜面，于上述條件下培養4～7 d 后，于4 ℃保存備用。

1.3 致病性鑒定

采用孢子懸浮液噴霧接種法進行致病性鑒定。將在PDA平板上培養4～7 d的菌株，用含2%的吐溫-20的無菌水配制成孢子懸浮液，分生孢子濃度為103～104個/mL。活體接種：取生長良好、長出2片真葉的健康黃瓜苗，用上述孢子懸浮液噴霧接種到黃瓜葉片上，接種后用塑料薄膜保濕48 h，然后正常管理。離體接種：取健康無病斑的成株期黃瓜葉片，放置于覆有濾紙的大培養皿中（葉柄用脫脂棉包好，保濕），用上述孢子懸浮液噴霧接種，保濕培養。每天觀察，記錄發病情況。發病后再從發病部位取樣進行再分離，以確定是否為致病菌。

1.4 病原菌的形態觀察

通過柯赫氏法則驗證，確定引起黃瓜靶斑病的病原。將供試菌株用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，接種到PDA平板上，于25±1 ℃培養箱中培養。描述菌落顏色、形態。挑取培養物，用Olympus生物顯微鏡觀察菌絲、分生孢子形態，測量其大小。

1.5 病原菌的鑒定

黃瓜靶斑病致病菌的鑒定，主要根據被害狀、培養性狀和孢子及菌絲體的顯微觀察，并結合相應的真菌鑒定手冊[3-4]。

2 結果與分析

2.1 黃瓜靶斑病的發病癥狀

大棚栽培的黃瓜中下部葉片上首先發病，以為害葉片為主，正反面均可受害。

2.1.1 發病初期 病害發生初期在葉片上形成黃色水浸狀斑點，直徑約1.0 mm。隨著病害加重，病斑直徑逐漸擴大，當擴展至1.5～2.0 mm時，葉片正面病斑略凹陷，病斑近圓形或稍不規則，有時因受葉脈所限而成多角形，病斑外圍顏色稍深、呈黃褐色，中間顏色稍淺、呈淡黃色（如圖1中A所示）。

2.1.2 發病中期 黃瓜靶斑病中期的發病癥狀如圖1中B所示。發病中期病斑擴大為圓形或不規則形，病健界限明顯，易穿孔，葉正面病斑粗糙不平，整體呈褐色，中央有一個灰白色的“靶心”，對光觀察顏色變化明顯，呈半透明狀。

2.1.3 發病后期 發病后期，病斑成圓形或不規則形，病斑中央有一明顯的“靶心”。發病嚴重時多個病斑連成片，成不規則狀，整個葉片干枯致死。濕度大時病斑上可生有稀疏灰黑色的霉狀物，成環狀，為病菌的分生孢子梗和分生孢子（如圖1中C所示）。

2.2 致病性鑒定

無論是活體接種還是離體接種，黃瓜葉片均可發病，產生與大棚內相似的癥狀。重新分離得到培養性狀和形態特征與接種菌一致的分離物。

2.3 黃瓜靶斑病菌的培養性狀

經單孢分離，得到純化的病菌。黃瓜靶斑病的菌絲初期為白色，菌落呈圓形；培養3 d后隨著菌絲的生長，菌絲顏色變暗，菌落逐漸向周圍擴大；培養15 d后，菌落成淺灰褐色，平鋪，質地致密，呈輻射狀展開，邊緣規則，氣生菌絲灰白色或灰褐色、絨毛狀，基生菌絲灰白色或淺褐色（如圖2所示）。為了防止細菌污染，培養基中可加入少量鏈霉素，其對病菌生長無影響。

2.4 黃瓜靶斑病病菌分生孢子及菌絲體形態觀察

2.4.1 菌絲形態 在PDA培養基上恒溫培養的黃瓜靶斑病病菌，其菌絲淡褐色或灰黑色，具分枝和隔膜；分生孢子梗直或彎曲，淺褐色，不分枝，有分隔，基部有時膨大。

2.4.2 分生孢子形態 PDA培養基上25±1 ℃條件下培養的黃瓜靶斑病菌，其分生孢子頂生，多單生，淺褐色，倒棍棒形或圓筒形，頂端鈍圓，直或稍彎曲，壁光滑，具1個至多個隔膜，孢子長度一般為34.42～316.92 μm，寬度為11.45～22.45 μm（如圖3所示）。產孢適溫為25±1 ℃；光照能促進菌絲的生長，但對孢子的產生有抑制作用；孢子的生長萌發需要一定的濕度。

3 結論與討論

溫室大棚內采集病樣，經實驗室內對病原菌進行分離培養、癥狀觀察、培養性狀和菌絲孢子形態鑒定及致病性測定，確定引起聊城地區黃瓜靶斑病的病原為Corynespora cassiicola，即半知菌亞門多主棒孢霉，該病原形態與前人研究[5-9]描述的黃瓜靶斑病（褐斑病）病原形態基本一致。

多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）自然侵染的寄主除了黃瓜之外，還能侵染番茄、茄子、煙草、紅麻、一串紅、一點紅、橡膠樹等[10-12]。人工接種還能侵染葫蘆科、無患子科、大戟科、番木瓜科、錦葵科、菊科、茄科、旋花科、莧科、豆科、天南星科、木樨科和楝科共13科24種植物[13]。該病原菌存在寄主專化性和致病性分化。該病害雖然在我國20世紀60年代就有記載，但是進入21世紀初期，多主棒孢霉（Corynespora cassiicola）侵染危害黃瓜的地域范圍迅速擴展，危害程度日益嚴重，主要集中在我國北部及西北部省份，且主要發生在設施栽培的黃瓜上，是一個日趨嚴重的病害，值得關注。

黃瓜靶斑病在高溫、高濕、晝夜溫差大、結露時間長的環境易發病，危害嚴重，在生產實踐中，應加強生態管理。為了控制該病害，使用化學藥劑時，建議選用藥劑混配來防治黃瓜靶斑病，如：4%四氟醚唑水乳劑+25%咪鮮胺水乳劑、40%稻瘟靈可濕性粉劑+25%咪鮮胺水乳劑和10%苯醚甲環唑微乳劑+25%咪鮮胺水乳劑，防效都在90%以上。在藥液中加入適量的葉面肥效果更好，噴藥重點是噴灑中、下部葉片[14-15]。

參考文獻

[1] 樊仲慶，謝永成，查仙芳.靶斑病對黃瓜光合作用的影響[J].江蘇農業科學，2013，41（8）：158-159.

[2] 戚佩坤，白金鎧，朱桂香.吉林省栽培植物真菌病害志[M].北京：科學出版社，1960.

[3] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上海科學技術出版社，1979.

[4] 呂佩珂，高振江，張寶棣.中國糧食作物、經濟作物、藥用植物病蟲原色圖鑒[M].呼和浩特：遠方出版社，1999.

[5] 劉鳴韜，徐瑞富，蔣學杰，等.黃瓜靶斑病研究初報[J].河南農業科學，2003（8）：33-35.

[6] 李寶聚，趙彥杰，于淑晶，等.李寶聚博士診病手記（六）——2008年秋季河北青縣黃瓜棒孢葉斑病大發生[J].中國蔬菜，2008（11）：51-52.

[7] 李長松，張眉，李林，等.山東省黃瓜棒孢葉斑病（褐斑病）病原菌鑒定和防治[J].中國蔬菜，2009（18）：29-33.

[8] 曾蓉，陸金萍，戴富明.上海地區黃瓜靶斑病病原鑒定及ITS的分析[J].上海交通大學學報：農業科學版，2011，29（4）：13-16.

[9] 鄒慶道，傅俊范，朱勇，等.黃瓜褐斑病病原菌鑒定及生物學特性研究[J].沈陽農業大學學報，2002，33（4）：258-261.

[10] 高葦，李寶聚，石延霞，等.多主棒孢菌在黃瓜、番茄和茄子寄主上致病力的分化[J].園藝學報，2011，38（3）：465-470.

[11] 張忠義，李繼新，關國經，等.烤煙棒孢霉葉斑病病原菌鑒定[J].中國煙草學報，2008，14（6）：44-47.

[12] 張麗麗，張敬澤，胡東維，等.一串紅葉斑病的病原菌鑒定[J].菌物學報，2008，25（5）：634-640.

[13] 劉以道，張欣，謝藝賢，等.巴西橡膠樹棒孢霉落葉病菌寄主范圍測定[J].熱帶農業科學，2008，28（6）：1-5.

[14] 邢光耀.幾種藥劑混配對黃瓜靶斑病的防治試驗[J].長江蔬菜（下半月刊），2013（8）：50-51.

[15] 金偉.黃瓜靶斑病的發生規律及綜合防治措施[J].農業科技與裝備，2013（11）：31-32.

Abstract： In recent years， cucumber target spot disease occurred frequently in protected areas of Liaocheng area. The disease sample was separated for doing pathogenicity identification， incubation traits observation and morphological identification， especially spore morphology was observed carefully under a microscope. The results showed that， the symptom of cucumber target spot was caused by Corynespora cassiicola in Liaocheng area. The colonial morphology is circular with inerratic edge， in the color of white or taupe， flush system， compact and radiate. The mycelium is in the color of light brown or ash black， with branches and septa. The conidiophore is direct or bent， in the color of light brown， no branches， with septa. The conidium is acrogenesis， solitary， in the color of light brown， inverted clavate or cylindrical， direct or slightly curved， smooth， with one or more septa. The length of the conidiospore is 34.42～316.92 μm， the width is 11.45～22.45 μm.

Key words： cucumber； target spot； pathogens； morphological characteristics； Corynespora cassiicola