廢啤酒酵母制取酵母抽提物的酶促工藝研究

吳滿剛雷姝敏卞君杰費立天于　海葛慶豐姜　虹周平凡

(1. 揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州　225127；2. 常州市菜根香生態農業有限公司，江蘇 常州　213000)

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廢啤酒酵母制取酵母抽提物的酶促工藝研究

吳滿剛1雷姝敏1卞君杰1費立天1于海1葛慶豐1姜虹1周平凡2

(1. 揚州大學食品科學與工程學院，江蘇 揚州225127；2. 常州市菜根香生態農業有限公司，江蘇 常州213000)

為了獲得廢啤酒酵母制取酵母抽提物的最佳工藝條件，通過單因素試驗獲得外加酶法制取酵母抽提物的最佳工藝條件，并比較其與傳統工藝條件的效果；使用GC—MS對最終產物進行風味分析。通過優化得到最佳工藝條件為添加中性蛋白酶，外加酶0.20%，pH 6.0，酶促溶時間36 h，得到的該抽提物中含有多種酸類、酯類和醇類等物質。研究表明，外加中性蛋白酶法是開發利用啤酒廢酵母制備酵母提取物的較好方法，得到的產物營養豐富。

啤酒；酵母；抽提物；蛋白酶；酶解；風味

廢啤酒酵母泥在本質上就是啤酒酵母，是在啤酒生產過程中經主發酵和后發酵釀造工藝后產生的[1]。酵母泥中富含蛋白質、維生素和微量元素等營養物質，具有很高的經濟價值[2]。中國是世界啤酒生產大國，每年生產約50萬t啤酒廢酵母，除很少部分被用作飼料外，大部分被排放，并未得到合理利用[3]。目前，中國對制取酵母抽提物工藝的研究主要有自溶法[3]、擴培法[4]、復合促溶法[5]和外加酶解法[6-7]等。由于外加酶法可以提高營養物質的獲得率，縮短提取時間，已經成為研究熱點[8]。

隨著生物酶技術的快速發展，啤酒廢酵母的加工利用向著精深加工方向發展。提高產品的科技含量，進行產品開發及各類直接或間接生物產品轉化，注重產品的高附加值是目前研究的重點。本試驗采用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶這3種成本較低，應用廣泛，大生產發展較優[8-10]的單種酶進行對比研究，對酵母抽提物酶促工藝條件進行優化，以期通過控制多種指標得到高得率、高呈味核苷酸含量的酵母抽提物產品。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料與試劑

木瓜蛋白酶(8.0×104U/g)、胰蛋白酶(1.1×105U/g)、中性蛋白酶(3.5×104U/g)、酪素：生化純，國藥集團化學試劑有限公司；

甲醛、氫氧化鈉(片狀)、碳酸鈉、氯化鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酚酞、乙醇、福林酚試劑等：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2主要儀器設備

紫外分光光度計：J-26XPI型，尤尼科(上海)儀器有限公司；

高壓均質機：Ultra-turrax型，上海智光儀器儀表有限公司；

恒溫水浴鍋：HH型，北京長安科學儀器廠；

冷凍離心機：Sorvall ST 16R型，賽默飛世爾科技公司；

酸度計：S20K型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

鼓風干燥箱：ZXRD-7230型，上海智城分析儀器制造有限公司；

旋轉蒸發器：SY200型，上海亞榮生化儀器廠；

氣質聯用儀：DSQⅡ型，美國賽默飛世爾科技公司。

1.2試驗方法

1.2.1工藝流程

廢啤酒酵母→脫苦→調配(蒸餾水∶酵母泥質量比為9∶1)→高壓均質(45 MPa處理2次)→酶解(50 ℃，恒溫自溶36 h)→滅酶(90 ℃，10 min)→冷卻(至室溫)→離心(常溫，3 000×g，10 min)→上清液→減壓濃縮(55 ℃)→醬狀酵母抽提物

1.2.2廢啤酒酵母脫苦取啤酒廢酵母離心(5 000×g，10 min)去上清液，2倍體積0.5% NaHCO3振蕩30 min，100目篩子篩分，2倍體積蒸餾水和0.5% NaHCO3分別洗滌，最終采用2倍體積蒸餾水離心洗滌2次[11]。

1.2.3酶促工藝條件的優化文獻[12～13]和[14]40都指出，酶促溶的最適溫度均在50 ℃左右，因此本試驗確定酶促溫度為50 ℃。

(1) 酶添加量對酶促溶影響：取10 g/100 g的酵母懸濁液80 mL，溫度控制為50 ℃，酶促溶時間30 h，pH 6.0，以氨基酸態氮得率和固形物得率為指標，考察酶添加量(0.00，0.10，0.20，0.30，0.40，0.50 g/100 mL，酶活以104U/g數量級計)對酶促溶影響。

(2) pH對酶促溶的影響：取10 g/100 g的酵母懸濁液80 mL，溫度控制為50 ℃，基于前述研究所得酶添加量，酶促溶時間30 h，以氨基酸態氮得率和固形物得率為指標，考察pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5)對酶促溶影響。

(3) 酶促溶時間對酶促溶的影響：取10 g/100 g的酵母懸濁液80 mL，溫度控制為50 ℃，基于前述研究所得酶添加量、pH，以氨基酸態氮得率和固形物得率為指標，考察酶促溶時間(12，18，24，30，36，42 h)對酶促溶影響。

1.2.4優化工藝條件與傳統工藝條件的對比以得到的3種酶的優化工藝條件與傳統的醇溶和鹽溶工藝進行對比研究。控制相同條件為：選取80 mL濃度為10 g/100 g的酵母懸濁液，酵母溶液45 MPa均質2次，自溶時溫度為50 ℃。

(1) 空白組[14]41：溶液pH 6.0，自溶時間36 h。

(2) 醇溶組[5]：添加1.0 mL/100 mL乙醇，溶液pH 6.5，自溶時間48 h。

(3) 鹽溶組[14]41-43：添加2.0 g/100 g氯化鈉，溶液pH 6.0，自溶時間36 h。

1.2.5測定方法

(1) 蛋白酶活力：福林法[15]。

(2) 游離氨基氮得率：甲醇滴定法[16]。游離氨基氮得率按式(1)計算：

(1)

式中：

yA——游離氨基氮得率，%；

m1——自溶后上清液氨基氮質量，g；

m2——自溶前酵母干重，g。

(3) 固形物得率：根據文獻[17]，固形物得率按式(2)計算：

(2)

式中：

ys——固形物得率，%；

m3——自溶后上清液總質量，g；

w1——上清液固形物含量，%；

m4——外加物質干重，g；

m2——自溶前酵母干重，g。

(4) 揮發性成分鑒定：稱取8 g最佳工藝條件獲得的酵母抽提物，裝入250 mL錐形瓶中鋪平，密封；50 ℃水浴平衡20 min；然后將固相微萃取針頭插入平衡后的錐形瓶中，推動手柄探出纖維頭，使纖維頭吸附40 min。

色譜柱：DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣為He(色譜純)；恒定流速1.2 mL/min；進樣口溫度設為250 ℃；初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至200 ℃，再以15 ℃/min升至260 ℃，保持3 min。

離子源：電子電離源(EI)；電子能量70 eV；質譜接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；溶劑延遲3 min；質譜掃描40～600 u。

根據得到的圖譜，參考文獻[18]進行定性分析。

2　結果與分析

2.1酶促工藝條件的優化

2.1.1酶添加量對酶促溶影響酵母的自溶過程主要是糖類物質和蛋白質等大分子物質在酶的水解作用下不斷降解的過程。蛋白質的降解導致游離氨基氮得率和固形物得率增加[6]。由圖1可知，隨著酶添加量的增加，蛋白質降解速率從迅速逐漸變緩。這是由于起初底物濃度遠大于酶濃度，增加酶量，酶與底物結合效率增加，蛋白質降解速率加快；其后，酶濃度逐漸飽和，蛋白質降解速率趨于平穩，最終再增加酶量已無法有效提高酶解效率[7]。綜合考慮，當木瓜蛋白酶添加量為0.4%，中性蛋白酶添加量為0.2%，胰蛋白酶添加量為0.025%時，游離氨基氮得率和固形物得率最高，即為3種酶最適宜添加量。

2.1.2pH對酶促溶的影響晏志云[14]39在研究中發現，酵母自溶時其pH變化趨勢是先緩慢上升然后再逐步下降。因而，研究中只需要在自溶開始時調節到適宜蛋白酶作用的pH，從而保證酶的活性和酶促反應速度。酶的催化能力與pH緊密相關，體系中pH變化，酶分子的構象、與底物分子的解離狀態等也隨之發生變化，從而影響酶與底物的結合[19]。當pH為酶適宜反應pH時，則促進酶的活性和酶促反應速度，酶解效果較好，固形物得率和游離氨基酸得率相對較高；反之，遠離該pH則起抑制效果。由圖2可知，

圖1　酶添加量對酶促溶的影響

pH 5.5，6.0，5.0分別是木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶促溶的理想酸堿度。

2.1.3酶促溶時間對酶促溶的影響由圖3可知：隨著酶促溶時間的延長，酵母抽提產品得率不斷增加，其風味也不斷改善，而后產品得率趨于穩定，風味將變得醇厚，最終產品得率幾乎不再增加。其中，木瓜蛋白酶的最佳酶促溶時間為36 h，與蔣雪薇等[5]的研究結果一致，而中性蛋白酶的為36 h，胰蛋白酶的為30 h。

終上所述，木瓜蛋白酶促溶的最佳工藝條件為：蛋白酶酶量為酵母溶液的0.4%，pH 5.5，自溶時間36 h，與陳軍[12]得到的結論相近；中性蛋白酶促溶的最佳工藝條件為：蛋白酶酶量為酵母溶液的0.2%，pH 6.0，自溶時間36 h；胰蛋白酶促溶的最佳工藝條件為：蛋白酶酶量為酵母溶液的0.025%，pH 5.0，自溶時間30 h。

2.2優化工藝條件與傳統工藝條件的對比

由圖4可知，添加蛋白酶的三組游離氨基酸得率和固形物得率均高于鹽溶組和空白組。其中，中性蛋白酶組的游離氨基酸得率達到4.34%，固形物得率達到62.02%，結果明顯優于胰蛋白酶組與木瓜蛋白酶組。因此，最優酶促工藝條件為：采用中性蛋白酶，蛋白酶酶量0.2%，溶液的pH 6.0，酶促溫度50 ℃，酶促溶時間36 h。

2.3揮發性成分鑒定

經GC—MS分析鑒定，所得酵母抽提物中揮發性化合物的GC色譜見圖5，各種化合物相對百分比含量比較見表1。

由表1可知，制得的酵母抽提物中測定出的揮發性化合物，主要有酸類(占15.34%)、酯類(占9.29%)、醇類(占1.99%)、醚類(占1.50%)和其他類(占9.13%)，是酵母抽提物的主要風味來源。

3　結論

綜合比較酶解和傳統工藝條件，得出當添加0.20%中性蛋白酶，pH 6.0，自溶36 h，50 ℃下促溶效果最佳。同時，得到的酵母抽提物富含多種風味物質。試驗中木瓜蛋白酶研究部分與前人[12]相似，同時在前人基礎上比較了更適用于大生產的工藝條件的優劣，為酶促提取酵母抽提物的大生產化作了一定理論補充。但并未在提高產品附加值方面進行更深入的研究，后續需著眼于附加值研究進行進一步探討。

表1　鑒定結果?

?酸類15.34%，酯類9.29%，其他9.13%，醇類1.99%，醛類1.50%。

圖3　酶促溶時間對酶促溶的影響

圖4　不同工藝條件處理效果的對比

圖5　風味分析圖譜

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Study on the preparation of beer yeast extract from its waste residue

WU Man-gang1LEIShu-min1BIANJun-jie1FEILi-tian1YUHai1GEQing-feng1JIANGHong1ZHOUPing-fan2

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou,Jiangsu225127,China;2.ChangzhouCaigenEcologicalAgricultureCo.,Ltd.,Changzhou,Jiangsu213000,China)

In order to acquire optimum conditions of preparation of yeast extract from its waste residue, single factor experiments were conducted to a good condition of adding external enzymes, and also it was compare with the traditional process. And then the GC—MS was used to analyze the flavor of the yeast extract for determining the best stratagem. Through optimization, the best optimum condition is that it adding 0.20% neutral protease and reacting for 36 h at pH 6.0. The final extract contained a variety of acids, esters, alcohols and other substances. The neutral protease method is shown a better way to acquire yeast extract. Moreover, the products obtained were with rich nutriment.

beer; yeasts; extract; protease; enzymatic hydrolysis; flavor

常州市科技支撐計劃(農業)項目(編號：CE20142020)；揚州大學中青年學術帶頭人資助

吳滿剛(1977-)，男，揚州大學副教授，博士。

E-mail: mgwu@yzu.edu.cn

2016-03-26

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.039