大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優選

劉雪輝張　思張志旭康信聰李　堅謝紅旗,3,4劉東波,3,4

(1. 湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙　410128；2. 國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南 長沙　410128；3. 湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙　410128；4. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙　410128)

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大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優選

劉雪輝1,2張思1,2張志旭1,2康信聰1,2李堅2謝紅旗1,2,3,4劉東波1,2,3,4

(1. 湖南農業大學園藝園林學院，湖南 長沙410128；2. 國家中醫藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南 長沙410128；3. 湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南 長沙410128；4. 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙410128)

以吸附—解吸率和總黃酮含量為考察指標，采用靜態和動態吸附兩種方法，進行大孔吸附樹脂純化薄荷總黃酮工藝優選。試驗考察ADS-7、ADS-17、NKA-9、AB-8、D101、HPD-100 六種大孔吸附樹脂對薄荷總黃酮的純化能力。結果表明：AB-8對薄荷總黃酮吸附與分離性能最佳，確定純化薄荷總黃酮的最佳工藝條件為：流速1 mL/min，上樣液中薄荷總黃酮質量濃度為2.56 mg/mL，上樣量3 BV，解析液為4 BV 30%乙醇，最終得到含量90.35%的薄荷總黃酮。上述工藝對薄荷總黃酮的分離高效、穩定、可靠，為薄荷資源的綜合利用提供理論依據。

薄荷；黃酮；分離；吸附；解析

薄荷(MenthahaplocalyxBrip．)又稱“銀丹草”、“魚香草”，為唇形科(Lamiaceae)薄荷屬(GenusMentha)多年生藥食兩用草本植物[1]。

現代研究發現，薄荷含有機酸、黃酮、揮發油、萜類等化學成分，對消化、呼吸、神經中樞等生理系統的藥理作用顯著[2]，其中的黃酮類物質具有較強的抗菌[3]、抗氧化[4-5]及抗腫瘤[6]能力，故被廣泛應用于醫藥、食品、化妝品等行業[7-8]。薄荷總黃酮顯著的生理活性催生了極大的市場需求，也對其產業化研究提出了更高的要求。傳統的硅膠柱分離以及溶劑萃取方式存在有機溶劑用量大、溶劑殘留等缺點，而制備色譜、高速逆流等分離方法也受到有機溶劑殘留以及無法大規模產業化生產等弊端的限制[9-10]，而現有的關于薄荷總黃酮產業化分離純化方面的研究不多。鐘昆芮等[11]采用聚酰胺樹脂分離純化了薄荷總黃酮，其方法雖然操作簡單、重復性好，但所得薄荷總黃酮純度僅達50%，在分離效果效率以及經濟成本等方面稍有不足，無法滿足其后續針對性的藥理藥效研究和市場推廣的需求，制約了薄荷資源的綜合開發利用。 大孔吸附樹脂是一種可重復利用的新型分離材料，具有對目標組分針對性吸附能力強、分離方法簡單、高效，溶劑無毒副作用等優點，常用于藥用植物中活性化合物的分離[12]，本研究擬通過對不同極性的樹脂進行篩查，并結合工廠大生產設備條件，對薄荷總黃酮純化工藝進行優化，旨在探索出綠色、高效、穩定、經濟的適用于產業化大生產的工藝路線。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

薄荷干燥莖葉：北京同仁堂藥材公司；

蘆丁標準品：含量>98%，中國藥品生物制品檢定所；

ADS-7樹脂、ADS-17樹脂、NKA-9樹脂、AB-8樹脂、D101樹脂、HPD-100樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司；

氫氧化鈉、無水乙醇、硝酸鋁：分析純，國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2主要儀器設備

紫外可見分光光度計：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司；

電子分析天平：Mettler Toledo XS205型，上海梅特勒—托利多儀器有限公司；

恒溫培養震蕩器：ZHWY-2102C型，上海合恒儀器設備有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52型，上海雅榮生化儀器設備有限公司。

1.3方法

1.3.1上樣液制備稱取薄荷干燥莖葉500 g，加入60%乙醇置80 ℃恒溫水浴鍋中回流提取1.0 h，料液比分別為1∶10和1∶8(g/mL)提取2次，合并提取液，60 ℃真空濃縮回收乙醇至無醇味，加水分散溶解，定容至2 000 mL，采用亞硝酸鈉—硝酸鋁—氫氧化鈉顯色法測定提取液中黃酮含量[13]，作為上樣液備用。

1.3.2靜態吸附與解析試驗準確稱取預處理好的ADS-7、ADS-17、NKA-9、AB-8、D101、HPD-100樹脂各1.0 g，裝入50 mL錐形瓶中，分別加入上樣液25 mL，置恒溫振蕩搖床上(溫度30 ℃，轉速100 r/min)振蕩吸附，每隔1 h吸取上層清液1 mL進行黃酮含量測定，按式(1)計算吸附量，優選出最佳吸附樹脂。

(1)

式中：

X——吸附量，mg/g；

a——上樣液中總黃酮濃度，mg/mL；

b——吸附后溶液中總黃酮濃度，mg/mL；

v——上樣液體積，mL；

m——樹脂質量，g。

將充分吸附薄荷總黃酮的大孔樹脂過濾后分別加入25 mL 80%乙醇，置恒溫振蕩搖床上(溫度30 ℃，轉速100 r/min)振蕩解吸24 h，充分解吸后取1 mL上層清液測定總黃酮含量，按式(2)、(3)計算解吸量和解吸率，并綜合吸附率與解析率優選出最佳樹脂型號進行動態吸附試驗。

(2)

(3)

式中：

a——上樣液中總黃酮濃度，mg/mL；

b——吸附后溶液中總黃酮濃度，mg/mL；

Y——解吸量，mg/g；

Z——解吸率，%；

c——解吸液中總黃酮濃度，mg/mL；

V——解吸液體積，mL；

1.3.3上樣液濃度及上樣量的篩選準確量取已預處理好的AB-8型大孔吸附樹脂各30 mL濕法裝柱，取一系列質量濃度(1.53，1.92，2.56，3.84 mg/mL)的上樣液分別上柱，以流出液中黃酮濃度達到上樣液中黃酮濃度的10%作為泄漏點，測定不同上樣濃度下樹脂的飽和吸附量，從而優先出最佳上樣濃度及上樣量。

1.3.4洗脫溶劑的篩選按上述確定的最佳吸附條件進行上樣，先水洗至流出液無色，然后依次用10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇各1 BV進行解析，流速1 mL/min，分別收集各段解析液進行黃酮含量檢測，繪制洗脫曲線并優選出最佳洗脫溶劑。

1.3.5洗脫量的篩選選用上述確定好的洗脫溶劑，流速1 mL/min，分別用1，2，3，4，5，6 BV的溶劑進行解析，計算解析量，并繪制解析曲線并優選出最佳解析體積。

2　結果與分析

2.1不同樹脂對薄荷黃酮的靜態吸附量與解析率

ADS-7、ADS-17、NKA-9、AB-8、D101、HPD-100 六種吸附材料對薄荷黃酮的靜態吸附量與解析量見表1，ADS-7樹脂對薄荷黃酮的吸附量最大，AB-8樹脂次之，但在靜態解析試驗中，AB-8樹脂的解析率最高，達到63.57%，具有較好的吸附解析效果，而同樣條件下ADS-7樹脂對薄荷黃酮的死吸附較多以致解析率只有15.8%，推測可能是薄荷黃酮類化合物極性較強，根據“相似相吸引”原則，ADS-7樹脂作為強極性樹脂，與薄荷黃酮極性相似度較高，具有較強的吸附效應，從而形成了死吸附。而AB-8樹脂相對極性較弱，在針對薄荷黃酮類化合物時能夠達到一種較佳的吸附—解析效應，因此綜合吸附量與解析率兩個因素，最終選擇AB-8樹脂作為薄荷總黃酮的純化填料。

2.2不同上樣液濃度下樹脂對薄荷總黃酮的吸附量

將薄荷提取濃縮液稀釋至黃酮含量分別為3.84，2.56，1.92，1.53 mg/mL，以泄露點為終點進行最大吸附量測定，結果見圖1。當薄荷黃酮濃度為2.56 mg/mL時，樹脂對薄荷總黃酮的吸附量最大，隨著濃度的減少，吸附量逐漸降低，而濃度增大也會導致泄露點提前而吸附量減少，且樹脂容易堵塞。因此選擇濃度為2.56 mg/mL的上樣液進行上柱試驗。

表1不同樹脂對薄荷黃酮的靜態吸附量與解析率

Table 1Static adsorption capacities and desorption rates of total flavonoids inMenthahaplocalyxby various macroporous adsorption resins

樹脂名稱極性吸附量/mg解析量/mg解析率%ADS-7強極性67.6210.6815.80ADS-17中極性41.8419.4746.54NKA-9極性 47.3024.3651.53AB-8弱極性48.5830.8863.57D101非極性47.2625.0352.96HPD-100非極性48.0328.4559.22

圖1　不同上樣液濃度下樹脂對薄荷總黃酮的吸附量

2.3上樣量的確定

按上述確定好的上樣濃度進行上柱，分別接收各段上樣流出液，檢測其中黃酮含量，見圖2，當上樣量達到3 BV時，流出液中薄荷總黃酮濃度達到上樣液濃度的10%，并且泄露量逐漸增大，參考前人[14]研究結果并綜合薄荷原料價格、薄荷總黃酮產業化生產成本、品價格等經濟因素，最終選擇上樣體積為3 BV。

2.4不同濃度的乙醇對薄荷總黃酮的解析率

如圖3所示，隨著醇濃度的增大，洗脫液中薄荷總黃酮的洗脫率也依次增大，當洗脫劑醇濃度達30%時，洗脫率達到了60%，繼續增加乙醇濃度，洗脫率增加趨勢減緩，且部分醇溶性雜質被洗脫下來而導致黃酮純度降低(圖4)。因此綜合經濟、效率等因素最終選擇先用水洗除去多糖、蛋白質等雜質，再用體積分數為30%的乙醇作為洗脫劑，并考慮通過增加洗脫量來提高洗脫率。

圖2　泄漏曲線

圖3　乙醇梯度洗脫曲線

圖4　乙醇梯度解析液中黃酮純度

2.5洗脫溶劑用量的篩選

選擇30%的乙醇作為洗脫溶劑，依次增加洗脫劑的用量，并分別接收每個BV的解析液，進行黃酮含量檢測。由圖5可知，當洗脫劑用量達到4 BV時，絕大部分黃酮已經被洗脫下來，因此選擇4 BV的洗脫劑用量。

圖5　洗脫劑用量與洗脫率的關系

3　結論

本試驗通過靜態吸附及解吸試驗進行樹脂型號的篩選，確定AB-8型樹脂對薄荷總黃酮的吸附量較大且解析率最高，且AB-8樹脂再生工藝簡單、重復利用批次可達數百次，因此選擇AB-8型樹脂做后續動態吸附試驗并優化其工藝參數，篩選出的最佳工藝條件為：上樣濃度2.56 mg/mL，上樣體積3 BV，水洗至流出液澄清透亮，再用4 BV 30%的乙醇

進行洗脫，洗脫率為79.49%，將解析液濃縮冷凍干燥，測得干粉中黃酮含量為90.35%。本試驗建立的AB-8型大孔吸附樹脂分離純化薄荷總黃酮的工藝，具有綠色環保、操作簡便、穩定可靠、高效經濟等優點，適合大規模產業化生產。

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Optimization of purification technology for total flavonoids from Mentha haplocalyx by macroporous resin

LIU Xue-hui1,2ZHANGSi1,2ZHANGZhi-xu1,2KANGXin-cong1,2LIJian2XIEHong-qi1,2,3,4LIUDong-bo1,2,3,4

(1.CollegeofHorticultureandLandscape,Hunanagriculturaluniversity,Changsha,Hunan410128,China; 2.StateKeyLaboratoryofSubhealthInterventionTechnology,Changsha,Hunan410128,China; 3.HunanProvincialKeyLaboratoryofCropGermplasmInnovationandUtilization,Changsha,Hunan410128,China; 4.NationalresearchCenterofEngineeringTechnologyForUtilizationofFunctionalIngredientsFromBotanicals,Changsha,Hunan410128,China)

Based on the adsorption-desorption rate and the content of total flavonoids, static and dynamic adsorption methods were adopted to evaluate the purification ability of 6 macroporous resins, including ADS-7, ADS-17, NKA-9, AB-8, D101, and HPD-100, for purifying total flavonoids from ofMenthahaplocalyx. The results showed that AB-8 was adsorbed best among all the candidates. The optimum purification condition was as follows. The flow rate was 1 mL/min, and the loading volume of sample was 3 BV containing flavonoids 2.56 mg/mL in it, desorbed by 4 BV 30% ethanol. Finally, 90.35% total flavonoids fromMenthahaplocalyxwere obtained. The method above is characteristic of high separation efficiency, convenient operation and reliable stability. This study could provide theory support for the comprehensive utilization ofMenthahaplocalyx.

Menthahaplocalyx; flavonoids; separation; adsorp-tion; desorption

國家國際科技合作專項項目(編號：2013DFA31790)

劉雪輝，女，湖南農業大學在讀碩士研究生。

劉東波(1970-)，男，湖南農業大學教授，博士。

E-mail：chinasaga@163.com

2015—10—22

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.038