食品微生物實驗室試劑耗材的質量控制

賀　燕 楊　滔 彭詩富

(湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙　410000)

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食品微生物實驗室試劑耗材的質量控制

賀燕 楊滔 彭詩富

(湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙410000)

試劑是食品微生物實驗室檢測工作中必不可少的消耗品，其質量直接影響到檢驗結果的準確性。文章從采購、外觀質量檢驗驗收和內在質量檢驗驗收，以及貯存和使用等方面全面分析了食品微生物實驗室試劑耗材的質量控制，其中重點分類講述如何進行商品化培養基和試劑的內在質量驗收，以對微生物實驗室的試劑耗材質量控制提供技術指導和參考。

微生物實驗室；試劑；實驗耗材；質量控制

食品微生物檢驗是評價食品衛生質量、保證食品安全、預防和控制食源性疾病的重要手段和防護線。為確保檢驗結果準確，應對影響檢驗結果各方面進行嚴格質量控制，才能保證檢驗結果準確無誤。食品微生物試驗的質量控制包括實驗室內部質量控制和實驗室間的質量控制。而實驗室內部質量控制則主要是從人、機、料、方、環、測六方面著手進行控制。為保證質量，依據《檢驗檢測機構資質認定評審準則》2015版[1]和CNAS-CL09:2013《檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明》[2]的要求，實驗室應保持對重要服務、供應品、試劑、消耗材料供應商的進行選擇和評價。食品微生物檢測中必不可少的試劑耗材主要包含一次性耗材、培養基、生化試劑、玻璃器皿等，其質量直接決定了檢測數據的準確性和可靠性。如果在采購、驗收、存貯、使用過程中忽視了任何一個環節的質量控制，都將影響到檢測結果的準確性。因此，食品微生物檢測實驗室應該要加強“料”環節中的試劑耗材的控制把關，確保檢測過程中檢驗結果的準確無誤。本文主要講述試劑耗材從采購、驗收、貯存、使用等方面進行質量控制。

1　一次性耗材的質量控制

食品微生物實驗室常用的一次性耗材主要有無菌培養皿、無菌吸管、無菌涂布棒、一次性接種環等。對其質量控制，實驗室首先應盡量選擇大企業生產的產品，嚴格杜絕三無廠家供應的產品，其次要嚴格做好驗收過程的質量控制。

1.1一次性耗材的外觀質量檢驗

每個批次的一次性消耗材料，按照包裝物或產品說明書上的方法開啟和使用。開啟前先觀察內包裝完整與否，開啟后，對該批次一次性消耗材料進行感官檢查，觀察是否存在異常情況，任何污染、受潮或物理性狀發生改變者不得通過檢查。

1.2一次性耗材內在質量檢驗

按照該批次的一次性消耗材料的交貨數量，至少抽取一個最小單個包裝作為測試抽樣樣品。對于無菌型的一次性耗材，在無菌條件下開啟內包裝物，按照產品分類分別取樣檢查：

(1) 短棒狀一次性無菌消耗材料(包括無菌采樣棉簽、接種環、接種針等)，直接將正常使用端插入10 mL溴甲酚紫葡萄糖肉湯大試管中，滅菌剪刀剪去手接觸過的部分，塞緊試管塞。

(2) 長棒狀一次性無菌消耗材料(包括移液管等)，直接將正常使用端插入10 mL溴甲酚紫葡萄糖肉湯大試管中，在漩渦混合儀上振蕩1 min或乳膠洗耳球吹吸10次，棄去測試材料，塞緊試管塞。

(3) 容器型一次性無菌消耗材料(包括菌種保存管、拍擊式均質袋等)，直接將溴甲酚紫葡萄糖肉湯注入待測試的容器中，液面高度不低于容器高度的2/3，無菌材料封閉容器口。

(4) 扁平型一次性無菌消耗材料(包括塑料平皿)，在無菌條件下直接將待測試材料放入適當的無菌容器(如拍擊式均質袋)中，注入適量溴甲酚紫葡萄糖肉湯，液面高度應保證將全部待測試物淹沒，折疊塑料袋口或包扎瓶口。

將上述處理后的檢樣置生化培養箱，(36±1) ℃培養5 d，觀察和結果判定。逐一觀察溴甲酚紫葡萄糖肉湯是否出現變色、渾濁、沉淀、絮狀、菌膜、產氣等情況，有時微生物增殖后可聚集成團，沉積在容器底部，發生這種情況時，小心振蕩容器后再進行觀察。如溴甲酚紫葡萄糖肉湯保持紫色清亮透明狀態，則判定為無菌試驗符合，方可投入使用，否則就按各自實驗室的規定進行處置。

1.3一次性耗材貯存和使用中的質量控制

微生物使用的一次性耗材如一次性培養皿、一次性吸管、槍頭等多為無菌產品，經驗收合格的產品應貯存在陰涼干燥處，以不利于滋生細菌和真菌。購買的一次性產品盡量不要放置時間太長，為確保不影響檢驗結果，在較長時間未使用產品時，無菌系類產品應對無菌試驗，非無菌系類產品在用于微生物檢測時應進行滅菌處理。

2　培養基和生化試劑的質量控制

培養基和生化試劑是用來培養和鑒定微生物的主要耗材，其質量的好壞直接決定著檢測結果，下面主要從采購、驗收、使用、貯存等方面介紹如何對培養基和生化試劑進行質量把關。

2.1培養基和生化試劑的供方評價

從試劑耗材的質量來看，不同的生產商家的產品，甚至同一廠家不同批號的產品都會存在差異[3]。合格供應商和廠家的選擇非常重要，應選擇產品市場信譽度高，有質量保證能力和服務能力的企業；企業是否通過質量管理體系的認證，企業的供貨能力，以及企業是否有保證試劑耗材質量的相應保證設備[4]，例如微生物檢測很多生化試劑都是有保存要求，供應商或企業應該至少應該有相應配套的低溫保藏設備，此外，供應商或企業應該要有良好的保存試劑耗材的場所。確定了合格的供應商和企業的話，試劑耗材的第一步質量關得到了保證。

2.2培養基和生化試劑的驗收檢驗

培養基和生化試劑采購回來之后，應對其進行入庫登記，并進行驗收。為確保質量，多數檢測實驗室在驗收時，會從外觀質量和內在質量兩方面著手。

2.2.1培養基和生化試劑的外觀質量檢驗對需要驗收的培養基和試劑(包括試劑盒)首先檢查該批次的供應商是否屬于本實驗室評定的合格供應商，以確保源頭可靠。對于商品化的培養基和試劑最好看是否有廠家的質控報告，目前中國的規模成型的培養基廠家都有對產品進行出廠前的檢測和控制。在進行外觀驗收時，要核查該批次培養基和試劑的包裝物或產品說明書上是否包括各種成分、添加成分名稱及產品編號、批號、最終pH(僅適用于大部分培養基)、存儲信息和有效期等基本信息。若不能滿足上述條件，可以不接受該批次培養基和試劑。對培養基和試劑(包括試劑盒)的內容物進行感官檢查，觀察其流動性、均勻性、結塊情況和色澤變化等[5]。任何受潮或物理性狀發生明顯改變的脫水培養基不得通過驗收，對于即用型培養基或試劑，出現污染、變質、明顯脫水或分層析出的，不得通過驗收。

2.2.2培養基和生化試劑的內在質量檢驗對培養基內在質量的驗收目的是確定培養基的質量性能是否能夠保證檢測結果的準確性。它主要利用已知的標準菌株按照標準的要求測定培養基和試劑的性能，可參考ISO/TS 11133—2003或SN/T 1538—2007以及GB 4789.28—2013，目前多數實驗室采用GB 4789.28—2013進行培養基和試劑的驗收[6]。針對不同類型的培養基和試劑可以采用定量、半定量和定性的測試方法，對于商品化的培養基和試劑多采用半定量和定性的測試方法。

對于選擇性的培養基采用目標菌和非目標菌的半定量方法，對于非選擇性的培養基僅采用目標菌的半定量方法，檢驗步驟為：

(1) 平板制作：將融化后的培養基傾注到培養皿中，并確保每個平皿中至少有3 mm厚的瓊脂層，如需要添加抗生素、維生素等附加試劑的培養基，應使培養基冷卻至50 ℃左右后方可添加。傾注培養基的平板經冷卻凝固后應立即使用或于2～8 ℃冰箱的密封保存待用。

(2) 工作液制作：將標準儲備菌株接種到非選擇性肉湯(例如BHI肉湯)培養過夜。各種商品化的培養基和試劑需要的目標菌和非目標菌的測試菌株按照GB 4789.28—2013附錄E的來選定。

(3) 接種：目標菌的半定量方法：用1 μL接種環按圖1進行平板劃線。具體操作：將平板分為A、B、C、D四區，其中A、B、C三區用接種環按0.5 cm的間隔劃4條平行線，D區內劃一條連續的“Z”字型曲線。非目標菌的半定量方法：用1 μL接種環按圖2在待測培養基表面劃6條平行直線。目標菌和非目標菌的半定量方法均要求接種兩個待測平板。

劃線時可在培養基下面放一個模板圖，并按標準規定的培養條件培養平板。操作時接種環應取一滿環接種物，為去除多余的液體，可將接種環在平邊緣輕觸3次。接種環與瓊脂平面以20°～30°的角度為適宜，劃線速度前后一致并快速連續。移取液體培養物時為防止環上產生氣泡或泡沫，應將接種環伸入培養液下部分。 通常用同一個接種環對同一個待測平板進行劃線時，操作過程不需要對接種環滅菌。

圖1　目標菌的半定量劃線

圖2　非目標菌的半定量劃線

(4) 結果判定：培養后，評價菌落的形狀、大小和生長密度，并計算生長指數G。每條有比較稠密菌落生長的劃線則G為1，每個培養皿上G最大為16。如果僅一半的線有稠密菌落生長，則G為0.5。如果劃線上沒有菌落生長、生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱，則G為0。記錄每個平板的得分總和便得到G。如菌落在A區和B區全部生長，而在C區有一半線生長，則G為10[7]。

目標菌在培養基上應呈現典型的生長。目標菌的生長指數G≥6時，培養基可以接受。一般非目標菌的生長指數G≤1，至少應小于5。選擇性分離和計數固體瓊脂培養基應滿足目標菌和非目標菌半定量G的參考范圍，非選擇培養基滿足目標菌的G值要求，因而一般較高。圖3為目標菌大腸艾希氏菌在非選擇性固體計數瓊脂平板PCA上G值生長情況(G=11)，圖4為目標菌在選擇性固體分離瓊脂平板EMB上G值生長情況(G=16)，圖5為非目標菌金黃色葡萄球菌在選擇性固體分離瓊脂平板EMB上G值生長情況(G=0)。

圖3　大腸埃希氏菌在PCA上G值

圖4　大腸埃希氏菌在EMB上G值

對于非選擇性增菌培養基、選擇性增菌培養基和液體計數培養基采用定性測試方法，檢驗步驟：首先將標準儲備菌株用非選擇性肉湯進行活化，制備成105～107CFU/mL的工作懸液，然后采用1 μL接種環取一環工作菌懸液接入待測培養基，按標準方法中的培養時間和溫度進行培養。最后采用目測濁度值進行結果判讀：0表示無渾濁，1表示很輕微的渾濁，2表示嚴重的渾濁，目標菌的濁度值應為2，非目標菌濁度應為0或1[7]。

以GB 4789.30—2010單核增生利斯特氏菌的選擇性增菌液LB1為例說明，分別接種ATCC19115單核細胞增生李斯特氏菌、ATCC25922大腸埃希氏菌、ATCC29212糞腸球菌30 ℃培養24 h，結果觀察：單核細胞增生李斯特氏菌渾濁生長，濁度為2，大腸埃希氏菌和糞腸球菌培養基澄清透明，濁度為0。

對于鑒定培養基采用定性的方法，鑒定培養基分液體培養基、半固體培養基、高層斜面培養基、平板培養基。

(1) 液體培養基：首先將測試菌液經過夜培養后，制成0.5個麥氏濁度的菌懸液，再取1～2滴到測試培養基中，按標準規定的方法進行培養后觀察，是否與標準規定的描述一致。圖6為單核增生李斯特氏菌鼠李糖和木糖試驗圖，木糖陰性，鼠李糖陽性。

(2) 半固體培養基：取質控菌株的新鮮斜面培養物，穿刺接種于半固體培養基，按規定的溫度進行培養觀察是否符合某類菌特有的生長特性。圖7為單核細胞增生李斯特氏菌在半固體上呈傘狀生長特性。

(3) 高層斜面培養基：取質控菌株的新鮮斜面培養物，穿刺接種于培養基底部，并在斜面劃“之”字形，經培養后觀察結果。例如大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌在TSI上就呈現出特有的生化現象：大腸埃希氏菌底層和斜面全部變黃，并產生大量氣體，培養基沖破；沙門氏菌斜面呈磚紅色，底層全部變黑；志賀氏菌斜面呈磚紅色，底層呈黃色，不產氣，圖8分別為對照、志賀氏菌、沙門氏菌、大腸埃希氏菌在TSI上呈現的生化特征。

圖6　木糖和鼠李糖反應

圖7　半固體培養基上的動力試驗

圖8　不同菌在TSI上反應特征

(4) 平板培養基：顯色培養基屬于最常用的平板鑒別培養基，通常來說常見不同細菌在目標菌顯色培養基會呈現不同的菌落和顏色特征，例如北京陸橋生產的沙門氏菌顯色培養基，目標菌沙門氏菌在該培養基上呈現紫紅色菌落，非沙門氏菌在該顯色培養基形成藍綠色菌落、無色菌落或者是抑制不生長。

對于生化試劑、診斷血清、微生物生化鑒定試劑盒等的驗收可按照是否具有選擇性或指示性進行區分，并參照GB 4789.28—2013中5.2.3.2和附錄E對于具體類別的規定進行技術性論證。如不能完全進行區分的，可以直接用相應的質控菌進行測試看是否符合要求。例如API20E試劑條，可以采用大腸埃希氏菌和沙門氏菌標準菌株進行測試，看是否相應菌的特性。對于生物梅里埃的VITEK生化鑒定條，其使用說明中就規定了各種類別的鑒定條相應的陰性和陽性質控菌，只要采用相應的指控菌上機使用，看能否驗證出檢出的菌與選用的指控菌相符。對于診斷血清的質量控制，只能選用相應血清型的菌逐一進行驗證。

對于經驗收合格的培養基和試劑方能投入使用，否則按照各自實驗室的規定進行處置。

2.3培養基和生化試劑在貯存過程中的質量控制

交貨驗收后的培養基和生化試劑(包括試劑盒)，應嚴格按照包裝物或產品說明書上提供的貯存條件、有效期進行保存。

一般來說，未開封的脫水培養基應避光儲存于25 ℃下陰涼干燥處，開過封的脫水培養基應蓋緊瓶蓋注意防潮，并在6個月內用完。應定期對儲存中的培養基試劑耗材進行常規檢查，如發現培養基和試劑發生結塊，顏色異常以及其他變質現象，則不能使用[8]。對于耗材在儲存過程中如出現長霉或形狀因溫度等原因發生變化以及其他異常現象，則不能使用。已配制好并經滅菌的培養基、應置于冰箱中保存，使用最好不要超過14 d。對于制備的平板，應置于4～8 ℃冰箱進行保存，最好避光保存，有些培養基見光影響其性能，例如BS、CN平板，放置時間最好不要超過14 d。

2.4培養基和生化試劑在使用過程中的質量控制

培養基和生化試劑應按照說明方法進行配置和滅菌方可使用。為避免因微生物繁殖而引起營養成分的消耗和pH值的改變，在培養基和試劑煮沸溶解后應立即進行配置，不可放置時間過長，也不可重復滅菌。每批培養基在初次使用時，應進行pH值的測量，并按標準對培養基進行pH值調整。為確保培養基和試劑滅菌效果達標，應定期對高壓滅菌設備進行化學和生物效果檢查。對熱敏感的培養基和試劑添加劑應按要求進行添加[9]。

3　結論

(1) 一次性耗材在申購時應盡量選擇大企業生產的產品，采取外觀質量檢驗驗收和內在質量驗收，對于無菌型的一次性耗材主要進行無菌試驗來驗證產品是否達到無菌效果。為控制一次性耗材質量，應在陰涼干燥處進行貯存，如長時間未使用無菌型的一次性產品應對其進行無菌試驗的監控，以確保不影響檢測結果。

(2) 培養基和試劑是食品微生物實驗室中用得最為廣泛的試劑耗材，直接決定了檢測結果，因而在申購、驗收、存貯、使用過程中要特別注意質量把關。不同類別培養基和試劑采用不同的方法進行技術驗收：對于選擇性的固體培養基采用目標菌和非目標菌的半定量方法，對于非選擇性的固體培養基僅采用目標菌的半定量方法進行內部質量驗收；對于非選擇性增菌培養基、選擇性增菌培養基、鑒定培養基和選擇性液體計數培養基采用定性測試方法進行驗收。

(3) 對于商品化的成套生化試劑、染色液、血清等其它試劑可參照GB 4789.28—2013對于具體類別的規定進行技術性驗收和驗證。如不能進行完全進行區分的，可以直接用相應的質控菌進行測試看是否符合要求。同時，各實驗室可按照生化試劑的特征性反應相應的驗收和質控規定。

(4) 試劑耗材的質量是食品微生物實驗室檢測工作的基礎，事關檢測工作的準確性和可靠性，在檢測工作中舉足輕重。如果在申購、驗收、存貯、使用過程中忽視了任何一個環節的質量控制，都將影響到檢測結果的準確性。因此，食

品微生物檢測實驗室應該要加強“料”環節中的試劑耗材的控制把關，確保檢測過程中檢驗結果的準確無誤。

[1] 檢驗檢測機構資質認定評審準則[S]. 北京: 中國標準出版社, 2015.

[2] CNAS-CL09:2013檢測和校準實驗室能力認可準則在微生物檢測領域的應用說明[S].北京: 中國合格評定國家認可委員會, 2014.

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[4] GB/T 27405—2008實驗室質量控制規范食品微生物檢測[S]. 北京: 中國標準出版社, 2008.

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[6] SN/T 1538.1—2005 培養基制備指南第一部分: 實驗室培養基制備質量保證通則[S]. 北京: 中國標準出版社, 2005.

[7] GB 4789.28—2013食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求[S]. 北京: 中國標準出版社, 2013.

[8] 楊滔. 全脂乳粉需氧芽孢總數檢驗不確定度的評定[J]. 食品與機械, 2013, 29(6): 82-84.

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Quality control of reagent in food microbiology laboratory

HE YanYANGTaoPENGShi-fu

(HunanInsituteofFoodQualitySupervisionandResereache,Changsha,Hunan410000,China)

As the indispensable supplies in food microbiology laboratory test, reagent supplies' quality directly affects the accuracy of the test results. To provide guidance for reagent supplies quality control, this article comprehensively analyzes the quality control of food microbiology laboratory from the respect of procurement, quality inspection & acceptance of appearance and immanency, storage, use, etc, and especially focus on internal quality acceptance of commercial medium and reagent.

microbiology laboratory; reagent; experiment supplies; quality control

賀燕(1982—)，女，湖南省食品質量監督檢驗研究院工程師，碩士。E-mail: 45023091@qq.com

2016—04—20

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.016