離子液體在無抗奶檢測中的應用

周鑫魁洪　霞錢瀅文鄧麗娟王杰斌高志瑩何海寧劉　琦

(1. 甘肅省商業科技研究所，甘肅 蘭州　730010；2. 甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅 蘭州　730010)

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離子液體在無抗奶檢測中的應用

周鑫魁1,2洪霞1,2錢瀅文1,2鄧麗娟1,2王杰斌1,2高志瑩1,2何海寧1,2劉琦1,2

(1. 甘肅省商業科技研究所，甘肅 蘭州730010；2. 甘肅中商食品質量檢驗檢測有限公司，甘肅 蘭州730010)

采用復分解方法合成疏水性離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽[(C8MIM)(PF6)]，用活性炭和大孔樹脂固相萃取小柱凈化該離子液體，得到無色透明的[(C8MIM)(PF6)]，產率87.6%。利用該離子液體萃取乳及乳制品中的青霉素及其酶解產物青霉素噻唑酸，并優化萃取條件。通過自建的高效液相色譜方法檢測青霉素及青霉素噻唑酸的含量，間接判斷乳及乳制品中是否為真正的“無抗奶”。離子液體萃取方法青霉素回收率為87.4%～92.6%，RSD為1.8%，檢出限5 ng/mL；青霉素噻唑酸回收率為83.5%～90.8%，RSD為2.4%，檢出限5 ng/mL，通過與杯碟法和液相質譜法作比較，更說明了該方法的優越性。

離子液體；β-內酰胺酶；青霉素；青霉素噻唑酸；高效液相色譜；乳及乳制品

青霉素作為一種高效、廉價的抗生素，是禽畜飼養治療、抵抗炎癥首選的藥物。抗生素濫用的危害在于加劇細菌耐藥性，正成為目前全球最迫切的公共衛生問題之一。如何嚴格控制、合理使用抗生素必須引起全社會的重視。在乳及乳制品的生產過程中，不法企業為了避免檢查出過量使用青霉素，人為地使用β-內酰胺酶去降解牛乳中殘留的青霉素，使青霉素酶解生成青霉素噻唑酸，生產人造“無抗奶”。所以判斷產品是否為真正的“無抗奶”，需要同時檢測青霉素和β-內酰胺酶是否殘留。目前檢測β-內酰胺酶的方法有微生物法，該方法靈敏度高，檢出限低，但是重復性不好，檢測周期過長[1]；碘量法操作簡便、快捷，為實驗室普遍使用，但是對反應時間要求嚴格，靈敏度和重現性不好[2-4]；酶聯免疫法[5-6]快速、高效，但是成本太高。高效液相色譜法具有高性能的檢測設備和先進的操作控制系統，自動化程度高、結果重復性好，但在檢測基質復雜的乳及乳制品時，需要對樣品進行比較繁瑣的前處理工作，而且處理過程一般為稀釋樣品，所以靈敏度不高[7-8][9]31-38[10-11]；液相色譜—串聯質譜法所需儀器價格昂貴[12]。因此建立一種簡單，快捷，靈敏度高的乳及乳制品的前處理方法是很有必要的。

離子液體在室溫或近于室溫情況下是由有機陽離子和無機陰離子組成的熔融鹽體系構成。由于離子液體獨特的性質，被廣泛應用在富集、分離、合成、催化、電化學等方面[13-16]。其中烷基咪唑類離子液體常被用于萃取和富集水溶液中的苯及苯的衍生物等[17]。并且烷基咪唑類離子液體與液相色譜柱及其流動相有很好的兼容性，可以作為樣品溶劑進入液相色譜儀[18]12-17。

但如何將離子液體應用到“無抗奶”的檢測中，同時檢測青霉素及其酶解產物青霉素噻唑酸卻很少有研究。趙洪秋[18]22-23利用1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，液—液微萃取的形式，萃取并檢測牛乳中青霉素的含量，得到較好的效果。但對于添加β-內酰胺酶，將青霉素分解為青霉素噻唑酸的人造“無抗奶”并沒有加以研究。而且1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的色譜行為與目標物近似，所以在趙洪秋色譜圖中，目標物周圍雜質較多。根據對“無抗奶”的檢測需求，合成并凈化得到無色透明的離子液體1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽。該離子液體疏水性更強，極性更弱。本身的色譜行為不影響目標物出峰。將[(C8MIM)(PF6)]液—液分散萃取技術應用在乳及乳制品中青霉素及青霉素噻唑酸的檢測試驗中，可以提高離子液體對目標物的富集程度，增加回收率。同時快速地對目標物進行凈化、萃取、濃縮。從而使樣品前處理更快捷，檢測結果更穩定，方法檢出限更低，靈敏度更高。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

N-甲基咪唑：分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；

1-氯正辛烷：優級純，上海麥克林生化科技有限公司；

六氟磷酸鉀：分析純，阿拉丁試劑上海有限公司；

青霉素標準品：標準品(97.5%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

β-內酰胺酶：分析純(500 U/mL)，阿拉丁試劑上海有限公司；

甲醇：色譜純，北京百靈威科技有限公司。

大孔樹脂固相萃取柱：4 g，12 mL，迪馬科技有限公司；

牛奶陰性樣品：蘭州莊園乳業有限責任公司。

1.2儀器與設備

液相色譜儀：安捷倫1260型，配二級管陣列檢測器，安捷倫科技有限公司；

旋轉蒸發儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

離心機：RX-II型，天美中國科學儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1離子液體合成根據文獻[13]修改如下：1-辛基-3-甲基咪唑氯化鹽的合成([C8MIM]Cl)：稱取0.25 mol(20.53 g)N-甲基咪唑和0.258 mol(23.88 g)1-氯正丁烷于100 mL燒瓶中，加熱回流24 h，用熱乙酸乙酯多次洗滌反應后的液體，棄去乙酸乙酯，70 ℃旋轉蒸發，得到淡黃色粘稠液體，備用；1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽的合成([C8MIM][PF6])：稱取1-辛基-3-甲基咪唑氯化鹽35 g溶于200 mL蒸餾水中，加入六氟磷酸鉀47 g，攪拌1 h，分為兩層，棄去上層后，用蒸餾水反復洗滌除去氯離子，在洗滌過離子液體的水中滴加0.1 mol/L的硝酸銀溶液，直到不產生白色沉淀，證明氯離子洗滌干凈。70 ℃旋轉蒸發去除水分，得到淡黃色粘稠液體。將該液體溶于200 mL色譜純甲醇中，加入10 g活性炭脫色。取上清液過大孔樹脂固相萃取柱，接收全部流出液，70 ℃旋轉蒸發去除多余溶劑。得到無色透明粘稠液體，備用。

1.3.2試劑配制稱取青霉素標準品10 mg，用0.05 mol/L pH 3.5乙酸銨溶解定容至10 mL，得到1 mg/mL青霉素溶液。使用時用0.05 mol/L pH 3.5的乙酸銨逐級稀釋至適當濃度。秤取青霉素標準品10 mg，用0.05 mol/L pH 6.0的乙酸銨溶解，加入1 mL 500 U/mL的β-內酰胺酶，37 ℃恒溫酶解30 min。得到青霉素噻唑酸標準溶液，使用時，用0.05 mol/L pH 3.5的乙酸銨逐級稀釋至適當濃度。

1.3.3樣品前處理稱取10.00 g牛奶樣品于離心管中，加入0.05 mol/L pH 3.5乙酸銨溶液30 mL，渦旋、超聲后，分別加入106 g/L亞鐵氰化鉀溶液和220 g/L乙酸鋅溶液各5 mL，渦旋震蕩，使其混合均勻后，于4 ℃，10 000 r/min離心5 min，取全部上清液置于另一支離心管中，分別加入1 mL離子液體和5 g氯化鈉，劇烈搖動2 min，使離子液體與上清液形成乳濁液，4 ℃，10 000 r/min離心5 min，目標物被離子液體萃取留在下層，取下層清液過0.45 μm濾膜，進行高效液相色譜測定。

1.3.4色譜條件為使青霉素與青霉素噻唑酸能良好分離，并且離子液體出峰不影響目標物色譜峰。目標物在流動相pH范圍內只有單一化合物形態。固自行建立色譜方法，色譜柱：C184.6 μm×150 mm分析柱；流動相：pH 3.5乙酸銨緩沖液—甲醇(體積比40∶60)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：225 nm。

1.3.5回收率及隔日試驗在牛奶陰性樣品中加入不同體積的青霉素及青霉素噻唑酸(由步驟1.3.2配制所得)標準溶液，使樣品中青霉素及青霉素噻唑酸含量分別為10，20，40 ng/mL，按照1.3.3的方法測定其含量，并計算回收率。將待測樣液常溫放置過夜，第2天再次測定其含量，計算回收率。

1.3.6樣液pH值對離子液體萃取效果的影響分別用0.05 mol/L pH值為2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0的乙酸銨緩沖液，配制1 μg/mL的青霉素和青霉素噻唑酸溶液，取1 mL經離子液體萃取后，進入液相色譜儀測定。

1.3.7標準工作曲線的線性回歸方程、相關性系數、線性范圍、最低檢出限及精密度試驗取50～50 000 ng/mL不同濃度的青霉素和青霉素噻唑酸溶液進行分析，以液相色譜的峰面積對目標物濃度求得回歸方程；以3倍信噪比為最低檢出限；取10份陰性樣品做青霉素和青霉素噻唑酸的藥物添加，按1.3.3的方法處理、測定，測得兩種物質的標準偏差。

1.3.8方法應用在10組陰性樣品中，人為隨機添加青霉素和β-內酰胺酶，放置1 d后，分別用杯碟法[2]、液相質譜法[12]、離子液體萃取法檢測。

2　結果與討論

2.1離子液體對青霉素和青霉素噻唑酸的萃取效果

陰性樣品、陰性樣品中添加青霉素及青霉素噻唑酸的加標樣品按照1.3.4的方法處理，經液相色譜儀檢測，得到相應的色譜圖及標準品色譜圖見圖1。由圖1(a)可知，離子液體從樣品中萃取的非目標物，并沒有在青霉素和青霉素噻唑酸的保留時間范圍內出峰，說明在該試驗條件下離子液體萃取的非目標物及離子液體本身對青霉素和青霉素噻唑酸的色譜峰沒有產生影響。對比圖1(b)和(c)可知，青霉素出峰時間約為2.9 min，青霉素噻唑酸出峰時間約為2.2 min，青霉素和青霉素噻唑酸峰型對稱，有良好的分離度，說明該色譜條件能完全滿足青霉素和青霉素噻唑酸的檢測。

圖1　青霉素和青霉素噻唑酸液相色譜圖

2.2回收率及隔日試驗

以藥物添加回收率評價離子液體萃取效果，以日內結果與日間結果的對比，評價青霉素及青霉素噻唑酸在離子液體中的穩定性，見表1。由表1可知，青霉素回收率為87.4%～92.6%，和文獻[18]20-23中所報道的85.5%～96.0%相似；青霉素噻唑酸回收率為83.5%～90.8%，而文獻[9]34-35中所用的常規液相方法，青霉素噻唑酸回收率僅為76.4%～81.3%。說明離子液體對青霉素和青霉素噻唑酸有良好的富集作用和萃取效果。而且日內結果和日間結果差異不大，RSD值小于5%。說明青霉素和青霉素噻唑酸在離子液體中較穩定。

2.3樣品溶液pH值對離子液體萃取的影響

每種pH值做5份平行試驗，結果見圖2。由圖2可知，青霉素和青霉素噻唑酸溶液的pH值在3～4時，離子液體

表1　青霉素及青霉素噻唑酸藥物添加回收率

圖2　pH值對萃取效果的影響

對目標物的萃取效率最高；pH值在5～7時，離子液體對目標物的萃取效率有所降低；pH值在7～10時，離子液體對目標物的萃取效率大幅降低。因為樣品溶液中的青霉素和青霉素噻唑酸在堿性條件下會轉化為青霉素鹽和青霉素噻唑酸鹽，而離子液體對鹽的吸附能力非常微弱。所以樣品應該用pH為3～4的緩沖液進行稀釋。

2.4標準工作曲線的線性回歸方程、相關性系數、線性范圍、最低檢出限及精密度

以線性范圍評價該方法的檢測濃度范圍，以相對標準偏差評價精密度和穩定性，結果見表2。由表2可知，該方法線性范圍寬，適合不同濃度樣品的分析。樣品前處理方法采用濃縮10倍的形式，當青霉素和青霉素噻唑酸最低響應濃度分別為46，49 ng/mL時，方法檢出限分別為4.6(≈5)，4.9(≈5) ng/mL。較林楠[9]37-38所使用的常規液相方法檢出限20 ng/mL更低。而青霉素和青霉素噻唑酸的RSD值均于3%，說明該方法符合檢驗的要求。

2.5方法應用

經微生物法[2]檢測β-內酰胺酶完成的樣品10組，其中2組為含有β-內酰胺酶的陽性樣品，再經液相質譜[12]確認，除含有β-內酰胺酶的陽性樣品外，其余9組仍有1組含有青霉噻唑酸，1組含有青霉素。

對上述10組用1.3.3的方法處理、測定。其中6組未檢出青霉素和青霉素噻唑酸，4組含有青霉素或青霉素噻唑酸，檢測數據見表3。由于β-內酰胺酶在產品加工過程中可能分解、變質，所以用杯碟法判斷是否含有β-內酰胺酶，很容易產生假陰性的結果。所以本方法能更準確地判斷樣品是否為真正的“無抗奶”。而按照文獻[12]液相質譜法，儀器設備需要高額成本，樣品前處理過程需要經固相萃取小柱凈化，操作復雜，造成試驗方法的相對標準偏差較大(3.02%～9.81%)。所以離子液體萃取，液相色譜檢測的方法結果準確、穩定，同時操作更方便快捷。

表2　線性回歸方程、相關性系數、線性范圍、檢出限及精密度數據

表3　該方法在實際樣品中的應用?

?+表示含有該成分；-表示不含有該成分；小括號中的數據為該物質的含量。

3　結論

離子液體[C8MIM][PF6]在pH為3～4時，對乳品中青霉素及青霉素噻唑酸的富集能力強。且富集效果穩定。富集后的青霉素及青霉素噻唑酸在本條件下能夠得到很好的分離度，凈化效果良好。整個試驗操作簡便快捷。克服了常規液相色譜法中操作繁瑣，靈敏度低的缺點。同時該方法回收率、精密度良好，準確度高，重顯性好。克服的微生物法假陰性率高，重現性不好的缺點。在實際樣品中應用良好，為真正的“無抗奶”檢測探索了一個很好的方法。在該方法的基礎上可以選擇更優的萃取條件和色譜條件，同時測定更多的抗生素。

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Application of ionic liquids in the detection of antibiotic negative milk

ZHOU Xin-kui1,2HONGXia1,2QIANYing-wen1,2DENGLi-juan1,2WANGJie-bin1,2GAOZhi-ying1,2HEHai-ning1,2LIUQi1,2

(1.GansuInstituteofBusinessandTechnology,Lanzhou,Gansu730010,China;2.GansuZhongshangFoodQualityTestandDetectionCo.,Ltd.,Lanzhou,Gansu730010,China)

Hydrophobic ionic liquid 1-octyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate [(C8MIM) (PF6)] was synthesized using metathesis method, and then the ionic liquid was purified by activated carbon and macroporous resin solid phase extraction column, to get a colorless, transparent product [(C8MIM) (PF6)] with a yield of 87.6%. The ionic liquids was used to extract penicillin and penicillin-thiazole acid hydrolysates in milk and dairy products, and its extracting condition was optimized. After that the content of penicillin and penicillin thiazole acid were detected by utilizing self-developed HPLC method, and it could be indirectly determined whether the milk and dairy products were true antibiotic negative milk. In this study, the recovery rate of penicillin by ionic liquid extraction method was 87.9%～92.6%, with RSD 1.8%, and the detection limit was 5 ng/mL. Moreover, the recovery rate of penicillin thiazole acid was found to be 83.5%～90.8%, with RSD 2.4%, and the detection limit was also 5 ng/mL. Compared with both plate and liquid chromatography mass spectrometry methods, our method here is more predominant.

ionic liquid; penicillin; penicillin-thiazole acid hydrolysates; HPLC; milk and dairy products

甘肅省科技計劃資助(編號：1504WKCA094，1309RTSA025，1009FTGA018，1505JTCA017)

周鑫魁，男，甘肅省商業科技研究所工程師，碩士。

洪霞(1966-)，女，甘肅省商業科技研究所高級工程師，碩士。E-mail：lzhongxia@126.com

2015—12—14

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.08.015