硒砂瓜連作地微生物群落變化及一株優(yōu)勢芽孢桿菌的分離鑒定

岳思君，李海榮，武珍珍，鄭 蕊，周 娟，蘇建宇

（1.西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室·寧夏大學生命科學學院 銀川 750021；2.寧夏民族職業(yè)技術學院 寧夏吳忠 751100）

砂田是在土地表面覆蓋厚度為7～20cm不同粒徑的礫石、砂或卵石后形成的特殊類型的土地，壓砂種植是中國西北干旱、半干旱地區(qū)的農(nóng)民經(jīng)過長期耕作實踐形成的一種抗旱、抗風蝕的耕作方式，有增溫、蓄水、保墑等作用[1-2]。中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)位于寧夏中部干旱帶，其環(huán)香山地區(qū)占全市面積的1/3。該地區(qū)干旱少雨，年降水量僅為189.5 mm，蒸發(fā)量卻為2 400 mm，沙礫遍地，晝夜溫差大，自然條件惡劣[3]。2004年以來，當?shù)卣鶕?jù)本地的氣候及種植條件，采用壓砂種瓜這一節(jié)水保墑的旱作農(nóng)業(yè)種植模式。壓砂瓜種植規(guī)模迅速擴大集中在中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)、中寧縣和海原縣。到2012年壓砂瓜種植面積連續(xù)5年穩(wěn)定在6.67萬hm2以上，已形成了壓砂瓜產(chǎn)業(yè)區(qū)域化、規(guī)模化發(fā)展格局[4-5]。壓砂西瓜中含有0.005 6 mg·kg-1硒元素，有延年益壽、抗衰老、抗癌的作用，獨具保健價值，因而得名為硒砂瓜[6]。用傳統(tǒng)壓砂抗旱法種植的硒砂瓜，以其品質好、無污染而備受客商和消費者青睞。

硒砂瓜主要種植模式為連作地種植，由于盲目施用農(nóng)藥和化肥，造成土壤生態(tài)環(huán)境惡化，硒砂瓜產(chǎn)量下降，品質變劣，連作障礙嚴重，不僅嚴重影響了硒砂瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和食品安全，而且威脅著消費者的健康。因此創(chuàng)造一個有利于生產(chǎn)的環(huán)境已成為一個急需解決的問題。連作障礙發(fā)生與土壤傳染性病害、土壤理化性狀劣變以及由根系分泌物和殘茬分解物等引起的自毒作用等有關，而這些因子均不同程度與土壤中的微生物有關[7-9]。多數(shù)學者認為連作引起土壤微生物區(qū)系發(fā)生了較大的變化，土壤微生物是連作障礙的主要因子之一，其群落結構組成及其變化在一定程度上反映了土壤的質量及其健全性[10-12]。為尋求安全有效的防治措施，生物防治越來越引起人們的關注。本文以不同連作年限的硒砂瓜種植區(qū)土壤微生物作為研究對象，了解硒砂瓜連作地微生物種類和數(shù)量變化規(guī)律，在此基礎上，對1株芽孢桿菌做了分類鑒定，以期用于連作障礙的生物防治。通過調(diào)節(jié)土壤的環(huán)境條件和改善它的微生物區(qū)系，從而發(fā)揮有益微生物的作用，降低有害微生物對土壤的影響，促進土壤培肥，為解決硒砂瓜產(chǎn)業(yè)種植過程中出現(xiàn)的連作障礙問題以及構建硒砂瓜可持續(xù)發(fā)展的技術體系提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

土樣取自寧夏中衛(wèi)市興仁鄉(xiāng)硒砂瓜種植區(qū)，依據(jù)瓜田連作年限不同，將連作瓜田劃分為連作1a、3a、5a、7 a和10 a共5個等級分別取樣。采用5點取樣法來，采集15cm左右土層的土壤，每個樣點取0.5 kg左右土樣，裝入密封袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 微生物分離方法

分別取不同年限的待測硒砂瓜土壤樣品1g，放入盛有9 mL蒸餾水的滅菌試管內(nèi)，將試管放入搖床內(nèi)經(jīng)過充分振搖，制成1∶10的均勻稀釋液。按照10倍稀釋法依次制成不同濃度梯度的稀釋液。以涂布平板法計數(shù)，取稀釋度為 1×103～1×105土壤懸浮液各100μL，分別接種于滅菌后的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基。每個濃度3次重復，細菌培養(yǎng)恒溫28℃培養(yǎng)3d，真菌培養(yǎng)恒溫25℃培養(yǎng)5d，放線菌28℃下培養(yǎng)7d后計數(shù)，結果以每g干土所含數(shù)量表示。選取每皿菌落數(shù)為15～150的稀釋度統(tǒng)計菌落數(shù)量，按下列公式計算菌落數(shù)量：菌落數(shù)量/（cfu·g-1）=（菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/干土質量。

1.3 細菌的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征

將優(yōu)勢細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上,28℃培養(yǎng),觀察18～24 h的菌落形態(tài)。挑取單菌落進行革蘭氏染色,并觀察菌體形態(tài)。

1.4 細菌的生理生化特性測定

采用生物梅里埃（biomerieux）Vitek32-BCL鑒定卡片進行數(shù)值法鑒定。

1.5 16SrDNA的PCR擴增與序列測定

提取細菌DNA，然后采用通用引物27f/1492r通過PCR擴增16SrDNA序列[11]。引物序列為27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492r：5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反應體系（25μL）：2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，27f（10 mol·L-1）0.5μL，1492r（10 mol·L-1）0.5μL，DNA 1μL，ddH2O 補至 25μL。PCR 反應程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72℃10 min。擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化后，與pMD18-T載體連接，轉化感受態(tài)細胞E.coliDH5α，選取陽性克隆測序，測序由上海生工基因公司完成。將測序結果在NCBI網(wǎng)站上用BLAST軟件與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫中相關種屬的16SrDNA序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 硒砂瓜不同年限連作土壤微生物群落變化規(guī)律

因為不同連作年限硒砂瓜土壤的根系分泌物、殘留在土壤中的植株，以及栽培管理方法都是相同的，這樣就形成了特定的連作硒砂瓜土壤微生物區(qū)系。隨著連作年限的增加，真菌的數(shù)量逐漸增加，而細菌和放線菌大量減少（表1）。可以看出，在連作3 a后，土壤中的真菌數(shù)量比1年土壤增加了39.13%；連作5 a，土壤中真菌數(shù)量比1年土壤增加了65.21%；連作10 a土壤中真菌數(shù)量較1 a土壤增加了130.43%。對于放線菌，連作3 a，土壤中的放線菌數(shù)量較1 a土壤減少了35.56%，連作7 a就會減少50%以上。對于細菌，連作3 a，較1 a土壤減少了16.67%；連作7 a，就會較1 a土壤來說減少48.15%；連作10 a較1 a土壤來說減少了66.67%。上述結果表明，土壤微生物內(nèi)，各個類群之間的平衡發(fā)生了非常大的改變。1 a土壤中的細菌與真菌的比值為235，而連作3 a，其比值就減小到了141。由此可見，連作會使土壤由細菌型轉向真菌型，最終導致地力衰竭，硒砂瓜生長不良，植株矮小，產(chǎn)量也會受到極大的影響。

表1 硒砂瓜不同年限土壤微生物區(qū)系

圖1 NB1菌落形態(tài)

2.2 NB1菌落形態(tài)及顯微鏡觀察

NB1細菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上培養(yǎng)以后，其菌落形態(tài)如圖1所示，菌株呈不規(guī)則的圓形，不透明，表面干燥，菌落表面有褶皺，邊緣不整齊。NB1菌株的革蘭氏染色結果如圖2所示，結果顯示，該細菌染色后顏色為紫色，形態(tài)呈桿狀，故初步判定菌株NB1為革蘭氏陽性菌（G+），為典型的芽孢桿菌。

2.3 NB1菌株的生理生化鑒定

對NB1菌進行生理生化鑒定（表2），檢測結果表明該細菌與枯草芽孢桿菌的相似性為87%，判斷其為枯草芽孢桿菌。

圖2 NB1革蘭氏染色（10×100倍）

表2 法國梅里埃VITEK-2型全自動微生物鑒定分析系統(tǒng)鑒定結果

2.4 NB1菌株的分子鑒定

2.4.1 NB1菌株的16SrDNA基因序列測定 利用細菌基因組提取試劑盒，提取NB1菌株的基因組DNA。經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA的純度和片段大小，細菌的總長度為15 kb左右，結果如圖3所示。

圖3 NB1菌基因組DNA電泳結果

2.4.2 NB1菌株16SrDNA全長PCR擴增 利用細菌通用引物，擴增NB1菌株16SrDNA全長，擴增產(chǎn)物用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增長度大概在1 500 bp左右（圖4）。

圖4 NB1菌株PCR擴增電泳結果

2.4.3 NB1菌株16SrDNA序列相似性比較 通過DNAMAN軟件分別將NB1菌株序列和其相似的各個序列進行多重比對，發(fā)現(xiàn)NB1菌株序列與Bacillus subtilis strian MX-1、Bacillus subtilis strainsubsp.stain DDKRC2和Bacillus licheniformis strain Dou6的16SrDNA序列的相似性均達到99%。因此依據(jù)16SrDNA序列同源性，并結合菌株的形態(tài)、生理生化特征等綜合分析，最終將該菌株確定為枯草芽孢桿菌。

3 討 論

關于連作障礙形成及加劇的原因是比較復雜的，導致其發(fā)生的因素較多且又相互影響，是植物-土壤系統(tǒng)內(nèi)多種因子綜合作用的結果。研究認為作物連作后，微生物種群受到嚴重破壞，主要微生物數(shù)量和土壤酶活性不同程度的下降[13-14]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，不同連作年限下，土壤中三大微生物類群的組成比例大體一致，即細菌最多，放線菌次之，真菌最少。硒砂瓜連作土壤由于同一類根系分泌物持續(xù)釋放，形成了特定土壤環(huán)境和根際條件，導致土壤微生物種類與數(shù)量變化,即細菌、放線菌數(shù)量下降，真菌數(shù)量升高，微生物區(qū)系從細菌型土壤向真菌型土壤轉化。一般認為真菌型土壤是地力衰竭的標志，真菌數(shù)量增加，意味著病害加重[2]。

利用微生物進行土壤生態(tài)修復、改變土壤微生物種群結構、重建土壤微生物系統(tǒng)動態(tài)平衡，已成為克服土壤連作障礙的重要手段，越來越引起重視。芽孢桿菌屬是革蘭氏陽性菌，能產(chǎn)生耐熱、耐旱、耐有機溶劑和抗紫外線的內(nèi)生芽孢。除了具有與其他生防菌相似的優(yōu)勢外，因能產(chǎn)生抗逆性強的芽孢因而極易在逆境條件下生存。芽孢桿菌類的生防菌劑也廣泛應用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的植物病蟲害防治。枯草芽孢桿菌是一種研究較多的生防菌，其能夠產(chǎn)生伊枯草菌素等抗生素類物質抑制植物致病真菌的生長[15-16]，而且枯草芽孢桿菌在施入植物根圍后，能在植物的根際表面形成一層結構穩(wěn)定的致密菌膜以防止致病菌的入侵[17]。關于枯草芽孢桿菌對植物致病菌防治方面的研究很多，芽孢桿菌類生防菌對絲核菌以及尖孢鐮刀菌有極強的抑制作用并且對由這些致病菌引起的番茄、馬鈴薯、黃瓜等作物的枯萎病有一定的防治效果。一些研究者還發(fā)現(xiàn)，由于其具有產(chǎn)生抗生素的特性，也可以用于采摘后水果的保鮮[18]。筆者通過對硒砂瓜連作地中分離出的一株優(yōu)勢芽孢桿菌NB1菌株的鑒定，為進一步探究其對硒砂瓜連作地的影響、改善土壤菌群結構、提高硒砂瓜產(chǎn)量提供優(yōu)良菌種。

4 結論

從不同連作年限的寧夏硒砂瓜種植區(qū)采集土樣進行活菌計數(shù)，結果表明，土壤微生物區(qū)系發(fā)生了較大的變化，隨著連作年限的增加，真菌的數(shù)量逐漸增加，而細菌和放線菌大量減少，連作會使土壤微生物由細菌型轉向真菌型。

硒砂瓜連作地中分離得到1株優(yōu)勢芽孢桿菌NB1，通過形態(tài)特征、生理生化反應結合16SrDNA基因序列分析，初步鑒定NB1菌株為枯草芽孢桿菌。為進一步研究其拮抗性能和對連作地土壤效應奠定基礎。