榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響*

陳小平，王志旺，劉彩民△，妥海燕，王瑞瓊靖遠縣中醫院，甘肅 靖遠 730600；甘肅中醫藥大學

榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響*

陳小平1，王志旺2，劉彩民1△，妥海燕2，王瑞瓊2
1靖遠縣中醫院，甘肅 靖遠 730600；2甘肅中醫藥大學

目的：探討榮骨定痛膏對骨性關節炎模型大鼠白介素1β（IL-1β）、一氧化氮（NO）及氧自由基代謝的影響。方法：采用注射4%木瓜蛋白酶復制骨性關節炎大鼠模型，通過觀測膝關節功能，血清IL-1β、關節液NO與NOS、關節組織氧自由基代謝等指標，探討榮骨定痛膏對骨性關節炎的治療作用及作用機制。結果：榮骨定痛膏可明顯減小骨性關節炎大鼠關節滑膜腫脹厚度，擴大膝關節的活動范圍，降低血清IL-1β、關節液NO 及NOS的水平，提高滑膜組織中SOD的活性而降低MDA的含量。結論：榮骨定痛膏對骨性關節炎模型大鼠具有一定治療作用，抑制IL-1β誘導的NO的產生而發揮抗氧化、抑制滑膜細胞的凋亡是其治療骨性關節炎的作用機制之一。

骨性關節炎；白介素1β；一氧化氮；抗氧化系統；榮骨定痛膏

骨性關節炎是一種慢性進行性骨關節功能與結構退行性疾病，屬臨床常見病，目前尚缺乏有效根治措施，作為非手術療法的中醫藥在治療慢性退行性疾病過程中顯示出獨特的療效而日益受到重視［1-2］。骨性關節炎屬中醫“痹證”范疇，多因腎氣虧虛、關節失養，復受風寒濕邪，氣血痹阻，經絡不暢而發，治療應補益肝腎、活血通絡、祛風散寒、勝濕止痛。基于上述中醫藥理論形成的榮骨定痛膏在臨床上取得了較好療效。本研究通過復制骨性關節炎大鼠模型，考察榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠膝關節結構與功能、IL-1β、NO及氧自由基代謝的影響，探討榮骨定痛膏防治骨性關節炎的作用及機制，為臨床用藥提供理論依據，現將結果報道如下：

1　材料與方法

1.1藥物榮骨定痛膏(每毫升軟膏劑含原生藥1.5 g，靖遠縣中醫院提供，批號：20140610)；鹽酸氨基葡萄糖膠囊(浙江誠意藥業有限公司生產，批號：20130603)。

1.2試劑木瓜蛋白酶(美國Sigma公司生產，批號：118K1461)；IL-1β試劑盒(北京華英生物技術研究所提供，批號：20140608)；NO、NOS、SOD、MDA與考馬斯亮藍蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所提供，批號：20140520、20140520、20140501、20140512與20140601)。其余試劑為分析純。

1.3動物SPF級SD雄性大鼠，體質量180～220g，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(甘)2004-0006，SPF級實驗室許可證號：SYXK(甘)2011-0001。

1.4儀器Cole-Parmer LabGEN125勻漿機(北京中科科爾儀器有限公司)；TGL-16G高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠生產)；N-5600PC型METASH可見分光光度計(上海元析儀器有限公司生產)；HH-S型恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司生產)；BS1103 sar torius電子天平(北京賽多里斯有限公司)。

1.5方法

1.5.1分組、造模及給藥取SD雄性大鼠48只，按體質量隨機分為6組，即正常對照組，模型對照組，氨基葡萄糖組(90mg/kg)，榮骨定痛膏高、中、低劑量組(120、60、30mg/d)各8只。各組大鼠膝關節及周圍皮膚脫毛，參照相關實驗方法［3-4］，在造模的第1、3、7天，將4%木瓜蛋白酶生理鹽水溶液50μL注入大鼠膝關節腔內，正常對照組注射等量生理鹽水。造模的同時給藥，即在大鼠膝關節涂抹不同濃度(1.500、0.750、0.375 g/mL)榮骨定痛膏40μL，氨基葡萄糖組灌胃0.9%氨基葡萄糖5mL/kg，正常對照組與模型對照組膝關節涂抹蒸餾水，2次/d，連續5周。

1.5.2取材、檢測指標末次涂藥2小時后，用水合氯醛麻醉大鼠，在室溫下由同一人測量被動膝關節活動度，即于膝關節等距離處垂直施以相等的力量伸展后回縮大鼠左、右膝關節，用量角器測量其伸展至回縮的角度并計算平均值［5］。股靜脈采血，待血液自然凝固2小時后，分離血清，按試劑盒說明書測定血清IL-1β的水平。取血后，向大鼠膝關節內注射生理鹽水，0.1mL/次，反復抽吸后，抽取關節灌洗液，每個關節抽洗3次，將關節灌洗液2 000 r/min離心10分鐘，取上清液測定NO、NOS的水平。處死大鼠，切取完整膝關節，立即打開關節腔，刮取關節面上的滑膜組織，用螺旋測微器于固定位置測定關節滑膜厚度［5］，之后立即置冰浴中的組織勻漿器內，加入冰生理鹽水，制成2%滑膜組織勻漿，在4℃下4 000 r/min離心10分鐘，取上清液，按試劑盒說明書測定SOD的活性及MDA的含量。

1.6統計學方法數據應用SPSS 11.5統計軟件分析，計量資料以±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠膝關節活動范圍、關節滑膜厚度的影響大鼠膝關節注射木瓜蛋白酶35天后膝關節活動范圍縮窄，關節滑膜腫脹厚度增加，與正常對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01)。經榮骨定痛膏治療后，膝關節的活動范圍擴大，關節滑膜腫脹厚度減小，與模型對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；與榮骨定痛膏低劑量組比較，榮骨定痛膏高劑量組的治療作用更強(P＜0.05)，見表1。

表1　榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠膝關節活動范圍、關節滑膜厚度的影響χ±s）

表1　榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠膝關節活動范圍、關節滑膜厚度的影響χ±s）

注：與正常對照組比較，※※表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與榮骨定痛膏低劑量組比較，▲表示P＜0.05。

組別　只數　劑量　關節活動范圍/°　關節滑膜厚度/mm正常對照組　8　-　158.86±7.79　0.25±0.04模型對照組　8　-　103.19±12.58※※　0.39±0.07※※氨基葡萄糖組　8　90mg/kg　127.25±13.13△△　0.28±0.05△△榮骨定痛膏高劑量組　8　120mg/d　133.03±14.12△△▲　0.30±0.05△▲榮骨定痛膏中劑量組　8　60mg/d　121.69±13.00△　0.32±0.06△榮骨定痛膏低劑量組　8　30mg/d　117.34±12.93△　0.36±0.06

2.2榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響復制骨性關節炎模型大鼠35天，血清IL-1β水平與關節灌洗液NO與NOS的水平升高，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)；經榮骨定痛膏治療后，IL-1β、NO與NOS的水平有所下降，其中榮骨定痛膏高劑量組及中劑量組與模型對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠關節組織中抗氧化酶及氧化產物的影響骨性關節炎模型大鼠關節滑膜組織中SOD的活性降低，MDA的含量增加，與正常對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.01)。榮骨定痛膏治療35天后，滑膜組織中SOD的活性顯著升高，MDA的含量下降，與模型對照組比較，差異有統計學意義(P＜0.05)；與榮骨定痛膏低劑量組比較，高、中劑量組的作用更強(P＜0.01)，見表3。

表2　榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響χ±s）

表2　榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠IL-1β、NO及NOS的影響χ±s）

注：與正常對照組比較，※※表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01。

組別　只數　劑量　IL-1β/（μg·L-1）　NO/（μmol·L-1）　NOS/（U·mL-1）正常對照組　8　-　0.093±0.015　6.16±1.34　2.33±0.41模型對照組　8　-　0.269±0.036※※　9.87±2.08※※　3.85±0.74※※氨基葡萄糖組　8　90mg/kg　0.241±0.035　7.98±1.70　3.41±0.69榮骨定痛膏高劑量組　8　120mg/d　0.208±0.033△△　7.18±1.51△　2.83±0.60△△榮骨定痛膏中劑量組　8　60mg/d　0.225±0.034△　7.72±1.70△　3.08±0.61△榮骨定痛膏低劑量組　8　30mg/d　0.231±0.035　8.36±1.73　3.45±0.68

表3　榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠關節組織中抗氧化酶及氧化產物的影響χ±s）

表3　榮骨定痛膏對骨性關節炎大鼠關節組織中抗氧化酶及氧化產物的影響χ±s）

注：與正常對照組比較，※※表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01；與榮骨定痛膏低劑量組比較，▲▲表示P＜0.01。

組別　只數　劑量　SOD/（U·mg-1）　MDA/（nmoL·mg-1）正常對照組　8　-　96.22±10.35　20.95±4.08模型對照組　8　-　64.87±7.97※※　102.58±16.75※※氨基葡萄糖組　8　90mg/kg　75.36±8.15△　83.70±14.93△榮骨定痛膏高劑量組　8　120mg/d　122.76±15.48△△▲▲　34.44±9.31△△▲▲榮骨定痛膏中劑量組　8　60mg/d　107.41±12.77△△▲▲　51.49±11.44△△▲▲榮骨定痛膏低劑量組　8　30mg/d　79.80±8.36△△　81.00±14.85△

3　討論

骨性關節炎(osteoar thritis，OA)也稱骨關節病、退行性關節炎等，好發于膝關節、髖關節、脊柱及手指等部位，是一種多發于老年人的慢性進行性骨關節疾病。隨著社會進入老齡化，該病發病率逐年增加。據統計，美、英等西歐國家有5%～10%的成年人患有骨性關節炎，此病與心血管疾病、創傷并列前3位，每年需手術治療者達幾十萬人，由此產生的社會經濟負擔對社會經濟發展有較大影響［6］。隨著我國社會人口結構的迅速老齡化，本病不但是公共衛生問題，而且也成為社會問題，日益引起人們的重視，因此，防治OA已成為各國骨科學界的重要課題。OA的發病機制復雜，但其基本病理變化為關節軟骨的退行性變與關節的增生性改變(特別是軟骨周圍及滑膜處)。目前臨床尚缺乏有效的根治措施，治療目的為緩解關節疼痛，改善關節功能并促進重建受損的軟骨及骨結構；由于手術治療缺乏確切有效的臨床治療方案，使得病程明顯延長，作為非手術療法的中醫藥日益受到人們的重視［7］。

中醫理論認為，OA多因腎氣虧虛，關節失養，局部勞損閉阻；復感風寒濕邪，經絡不暢，氣血痹阻，關節寒凝、痰阻，不通則痛，故治療應補益肝腎、活血通絡、祛風散寒、勝濕止痛［8-9］。在此基礎上擬定的榮骨定痛膏由山茱萸、杜仲、牛膝、當歸、秦艽、獨活、川烏等40余味中藥組成，臨床應用效果良好。本動物實驗結果顯示，榮骨定痛膏可明顯擴大病變關節的活動范圍，減小滑膜腫脹厚度，改善骨性關節炎關節的結構與功能。

IL-1是最早也是最重要的骨性關節炎促炎因子，成熟的IL-1β是由IL-1轉換酶裂解IL-1β前體而來［10］。在正常關節中IL-1含量極少且主要是IL-1β，在骨性關節炎中，IL-1特別是IL-1β的含量異常升高。骨性關節炎中IL-1影響軟骨細胞的結構和功能，促進其凋亡，打破軟骨基質合成與代謝間的平衡，使滑膜炎性病變，最終導致關節軟骨的破壞。在關節軟骨中，軟骨細胞對于保持關節軟骨功能和結構發揮著重要作用，IL-1參與關節軟骨破壞的起始和進展：一方面，IL-1殺傷線粒體呼吸鏈，導致線粒體功能紊亂，軟骨細胞的能量供應減少，使軟骨細胞活性下降［11］；另一方面，IL-1激活并提高誘導型一氧化氮合酶的活性，使NO合成增加［12］，而一氧化氮可促進軟骨細胞的分解代謝，加速軟骨細胞的凋亡［13］。同時，一氧化氮屬于活性氮自由基，可引起活性氧的產生而加速脂質過氧化反應，對DNA、內質網及膠原合成酶造成損傷，導致軟骨細胞功能紊亂［14］。骨性關節炎時滑膜常出現異常病變，IL-1通過影響NO控制線粒體功能，影響細胞周期蛋白而損害骨性關節炎中的滑膜細胞［15］。本實驗證實榮骨定痛膏在治療骨性關節炎的過程中可降低IL-1β、NO及NOS水平，提高滑膜組織中SOD的活性而降低MDA的含量。

綜上所述，榮骨定痛膏對骨性關節炎有一定治療作用，緩解IL-1、NO及氧自由基代謝的異常變化是其作用機制之一。

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The In fluence of RongGu DingTong Ointm ents on IL-1β，NO and Oxygen Free RadicalMetabolism ofOA Rats

CHEN Xiaoping1，WANG Zhiwang2，LIU Caimin1△，TUO Haiyan2，WANG Ruiqiong2
1 Jingyuan County TCM Hospital，Jingyuan 730600，China；2 Gansu University of Traditional Chinese Medicine

Objective：To discuss the effectsof RongGu DingTong ointmenton IL-1β，NO and oxygen free radicalmetabolism of the ratsw ith osteoarthritis（OA）.Methods：OA ratmodelwasestablished by injecting 4%papain，therapeutic effects and itsmechanism of RongGu DingTong ointmentwere studied by observing knee joint function，the contentsof IL-1β，NO and NOS，and oxygen free radicalmetabolism in joint tissue.Results：RongGu DingTong ointmentcould reduce the thicknessof jointsynovialswelling of OA rats，increase the range ofmotion of knee joint，decrease the levels of IL-1β，NO and NOS，and improving SOD activity in synovial tissue therefore to decrease the contents of MDA.Conclusion：RongGu DingTong ointment is effective in treating OA rats to a certain degrees，one of itsmechanisms is inhibiting NO generation induced by IL-1β，hence to develop antioxidant functions and inhibit theapoptosisof synovialcells.

osteoarthritis；IL-1β；NO；antioxidantsystem；RongGu DingTong ointment

R684.3

A

1004-6852（2016）07-0023-04

2015-06-25

甘肅省中醫藥管理局科研課題基金項目（編號GZK-2013-38）。

陳小平（1971—），男，副主任醫師。研究方向：風濕病、骨病的中醫藥研究與治療。

劉彩民（1956—），男，副主任醫師。研究方向：風濕病、骨病的中醫藥研究與治療。