黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法

何啟剛+黃開榮

摘要：免疫血清是緊急預防和早期治療相應傳染病的有效制劑。對黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法進行了介紹。

關鍵詞：黔北麻羊；小反芻獸疫；免疫血清；制備方法

中圖分類號：S858.26 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）06-0032-01

免疫血清是用純制的抗原多次接種于適當的成年健康動物，刺激其產生免疫應答，血清中含有大量特異性抗體，又稱抗血清。可以直接取用，也可將血清抗體提純為精致免疫球蛋白。小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR），又名小反芻獸偽牛瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病。主要感染小反芻動物，以發熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。OIE將其列為A類疫病。我國規定為一類動物疫病。免疫血清是緊急預防和早期治療相應傳染病的有效制劑。本文對黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法進行了介紹，供參考。

1 免疫用動物

以黔北麻羊為免疫用動物，要求反應良好，1～3歲，雄性，健壯，無感染性疾患，能夠提供足夠數量的血清。此外還需十分注意羊的飼養，以消除羊的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。

2 免疫方法

采用肌肉分點注射；每點注射1頭份，每次注射4～6個點。首免后8 d免疫第二次。免疫時用不完全佐劑。在第2次加強免疫后2周，取靜脈血2～3 mL，制備血清，檢測抗體效價。如未達到預期效價，需再次進行加強免疫，直到滿意時為止。當抗體效價達到預期水平時，即可放血制備抗血清。

3 佐劑

由于不同個體對同一抗原的反應性不同，而且不同抗原產生免疫反應的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質，以刺激機體產生較強的免疫反應，這種物質稱為免疫佐劑。佐劑除了延長抗原在體內的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是它能刺激網狀內皮系統，使參與免疫反應的免疫活性細胞增多，促進T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產生。常用的佐劑是弗氏佐劑，其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例視需要可調整為1∶2～9（V/V），這是不完全弗氏佐劑，在每毫升不完全弗氏佐劑中加入1～20 mg卡介苗就成為完全佐劑。配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4 ℃下保存備用。免疫前取等體積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等體積抗原液（其中加卡介苗3～4 mg/mL或不加），加完后再繼續研磨成乳劑，至滴于冰水上5～10 min內完全不擴散為止。為避免抗原損失，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復抽吸，約數十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

4 抗血清的采集與保存

采羊頸靜脈血。采血前停止喂料8 h（只給水），每只羊每次可收集160～200 mL。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。2周后，可再次放血。此法可反復多次放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。收集的血液置于室溫下1 h左右，凝固后，置4 ℃下過夜（切勿冰凍）析出血清，4 000 r/min離心10 min。在無菌條件下吸出血清，加適量青、鏈霉素，分裝，貯于-40 ℃以下冰箱，或凍干后貯存于4 ℃冰箱保存。

5 抗血清質量的評價

在免疫期間，同一動物在不同的時間內抗血清效價、特異性、親合力等都可能發生變化，因而必須經常采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。

5.1 效價

用小后芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢測抗血清效價，效價就是指血清中所含抗體的濃度或含量，即免疫羊中PPRV抗體水平。此法測定的效價極為精確。如抗血清陽性對照阻斷率（PB）大于70就可以用來做抗血清。

5.2 特異性測定

血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應的抗原及近似的抗原物質的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強。通常特異性是以交叉反應率來表示的。交叉反應率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質分別做競爭抑制曲線，計算各自的結合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應率。S=y/Z×100%，式中，S為交叉反應率，y為IC50時抗原濃度，Z為IC50時近似抗原物質的濃度。如某抗原的IC50濃度為90 Pg/管，而一些近似抗原物質IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其他抗原物質的交叉反應率近似零，即無交叉反應，該抗血清的特異性是好的。

5.3 親合力

在免疫學中，親合力是指抗體與結合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結合疏松，結合后會迅速解離，稱為親合力低，反之親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結合位點與抗原的決定基之間的立體結構型的合適程度決定的。親合力常以親合常數K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012 L/mol之間，也有高達1014 L/mol的。計算親合常數的方法有20余種，計算出的K都不能真實反映試驗情況，只能作為參考。

6 免疫失敗的可能原因及應采取的措施

有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。一是抗原質量是否良好，可改用其他廠家的產品或改用同一廠家的其他批號，也可考慮改變抗原分子的部分結構，或改進提取方法。二是所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其他佐劑，或加強乳化。三是免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數，免疫的途徑是否合適。四是動物的飼養是否得當，如營養（飼料、飲水）、環境衛生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。