黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法

何啟剛+黃開榮

摘要：免疫血清是緊急預防和早期治療相應(yīng)傳染病的有效制劑。對黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法進行了介紹。

關(guān)鍵詞：黔北麻羊；小反芻獸疫；免疫血清；制備方法

中圖分類號：S858.26 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）06-0032-01

免疫血清是用純制的抗原多次接種于適當?shù)某赡杲】祫游铮碳て洚a(chǎn)生免疫應(yīng)答，血清中含有大量特異性抗體，又稱抗血清。可以直接取用，也可將血清抗體提純?yōu)榫旅庖咔虻鞍住Ｐ》雌c獸疫（peste des petits ruminants，PPR），又名小反芻獸偽牛瘟，是由小反芻獸疫病毒引起的一種急性病毒性傳染病。主要感染小反芻動物，以發(fā)熱、口炎、腹瀉、肺炎為特征。OIE將其列為A類疫病。我國規(guī)定為一類動物疫病。免疫血清是緊急預防和早期治療相應(yīng)傳染病的有效制劑。本文對黔北麻羊小反芻獸疫免疫血清的制備方法進行了介紹，供參考。

1 免疫用動物

以黔北麻羊為免疫用動物，要求反應(yīng)良好，1～3歲，雄性，健壯，無感染性疾患，能夠提供足夠數(shù)量的血清。此外還需十分注意羊的飼養(yǎng)，以消除羊的個體差異以及在免疫過程中死亡的影響。

2 免疫方法

采用肌肉分點注射；每點注射1頭份，每次注射4～6個點。首免后8 d免疫第二次。免疫時用不完全佐劑。在第2次加強免疫后2周，取靜脈血2～3 mL，制備血清，檢測抗體效價。如未達到預期效價，需再次進行加強免疫，直到滿意時為止。當抗體效價達到預期水平時，即可放血制備抗血清。

3 佐劑

由于不同個體對同一抗原的反應(yīng)性不同，而且不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強有弱，因此常常在注射抗原的同時，加入能增強抗原的抗原性物質(zhì)，以刺激機體產(chǎn)生較強的免疫反應(yīng)，這種物質(zhì)稱為免疫佐劑。佐劑除了延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加抗原刺激作用外，更主要的是它能刺激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，使參與免疫反應(yīng)的免疫活性細胞增多，促進T細胞與B細胞的相互作用，從而增強機體對抗原的細胞免疫和抗體的產(chǎn)生。常用的佐劑是弗氏佐劑，其成分通常是羊毛脂1份、石臘油5份，羊毛脂與石臘油的比例視需要可調(diào)整為1∶2～9（V/V），這是不完全弗氏佐劑，在每毫升不完全弗氏佐劑中加入1～20 mg卡介苗就成為完全佐劑。配制方法：按比例將羊毛脂與石蠟油置容器內(nèi)，用超聲波使之混勻，高壓滅菌，置4 ℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ庖咔叭〉润w積完全或不完全佐劑與免疫原溶液混合，用振蕩器混勻成乳狀，也可以在免疫前取需要量佐劑置乳缽中研磨，均勻后再邊磨邊滴加入等體積抗原液（其中加卡介苗3～4 mg/mL或不加），加完后再繼續(xù)研磨成乳劑，至滴于冰水上5～10 min內(nèi)完全不擴散為止。為避免抗原損失，亦可用一注射器裝抗原液，另一注射器裝佐劑，二者以聚乙烯塑料管連接，然后二者來回反復抽吸，約數(shù)十分鐘后即能完全乳化。檢查合格后即以其中一注射器作注射用。

4 抗血清的采集與保存

采羊頸靜脈血。采血前停止喂料8 h（只給水），每只羊每次可收集160～200 mL。然后用棉球壓迫止血，凝血后洗去二甲苯。2周后，可再次放血。此法可反復多次放血。放血過程中要嚴格按無菌要求進行。收集的血液置于室溫下1 h左右，凝固后，置4 ℃下過夜（切勿冰凍）析出血清，4 000 r/min離心10 min。在無菌條件下吸出血清，加適量青、鏈霉素，分裝，貯于-40 ℃以下冰箱，或凍干后貯存于4 ℃冰箱保存。

5 抗血清質(zhì)量的評價

在免疫期間，同一動物在不同的時間內(nèi)抗血清效價、特異性、親合力等都可能發(fā)生變化，因而必須經(jīng)常采血測試。只有在對抗血清的效價、特異性、親合力等方面作徹底的評價后，才可使用所取得的抗血清。

5.1 效價

用小后芻獸疫阻斷ELISA抗體檢測試劑盒檢測抗血清效價，效價就是指血清中所含抗體的濃度或含量，即免疫羊中PPRV抗體水平。此法測定的效價極為精確。如抗血清陽性對照阻斷率（PB）大于70就可以用來做抗血清。

5.2 特異性測定

血清的特異性或稱專一性是指抗血清對相應(yīng)的抗原及近似的抗原物質(zhì)的識別能力。特異性好就是抗血清的識別能力強。通常特異性是以交叉反應(yīng)率來表示的。交叉反應(yīng)率低，表示抗血清的特異性好，反之則特異性差。交叉反應(yīng)率一般是用競爭抑制曲線來判斷的。以不同濃度的抗原和近似抗原物質(zhì)分別做競爭抑制曲線，計算各自的結(jié)合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50時的濃度，按下列公式計算交叉反應(yīng)率。S=y/Z×100%，式中，S為交叉反應(yīng)率，y為IC50時抗原濃度，Z為IC50時近似抗原物質(zhì)的濃度。如某抗原的IC50濃度為90 Pg/管，而一些近似抗原物質(zhì)IC50濃度幾乎是無限大，可以說這一抗血清與其他抗原物質(zhì)的交叉反應(yīng)率近似零，即無交叉反應(yīng)，該抗血清的特異性是好的。

5.3 親合力

在免疫學中，親合力是指抗體與結(jié)合抗原體的活度或牢固度。抗體與抗原結(jié)合疏松，結(jié)合后會迅速解離，稱為親合力低，反之親合力高。親合力的高低是由抗原分子的大小、抗體分子的結(jié)合位點與抗原的決定基之間的立體結(jié)構(gòu)型的合適程度決定的。親合力常以親合常數(shù)K表示。K的單位是升/摩爾（L/mol）。在RIA中，K是該抗血清能達到的最小檢出量（靈敏度）的倒數(shù)，K=1/[H]，[H]是最小檢出量，通常，K的范圍在108～1012 L/mol之間，也有高達1014 L/mol的。計算親合常數(shù)的方法有20余種，計算出的K都不能真實反映試驗情況，只能作為參考。

6 免疫失敗的可能原因及應(yīng)采取的措施

有時不能獲得滿意的抗血清，可從下列幾方面找原因，并改進之。一是抗原質(zhì)量是否良好，可改用其他廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其他批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法。二是所用的佐劑是否合適，乳化是否完全，可改用其他佐劑，或加強乳化。三是免疫的方法、劑量，加強免疫的間隔時間和次數(shù)，免疫的途徑是否合適。四是動物的飼養(yǎng)是否得當，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。