高產(chǎn)纖維素木醋桿菌的篩選及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

王良

（黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

高產(chǎn)纖維素木醋桿菌的篩選及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

王良*

（黑龍江生物科技職業(yè)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150025）

我國細(xì)菌纖維素生產(chǎn)存在的主要問題有產(chǎn)量低、成本高等。本實(shí)驗(yàn)通過誘變篩選出一株較佳產(chǎn)細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌，利用玉米糖化液為碳源，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，獲得了較好效果，對(duì)于提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，降低發(fā)酵成本均有較好的效果，也為細(xì)菌纖維素的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

木醋桿菌；誘變；發(fā)酵

目前，細(xì)菌纖維素的生產(chǎn)成本較高。究其原因，一方面是傳統(tǒng)方法需使用的培養(yǎng)基較昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本過高，難以產(chǎn)業(yè)化[1-3]；另一方面是傳統(tǒng)方法多使用淺盤發(fā)酵，缺乏具有轉(zhuǎn)化效率高、產(chǎn)量高、遺傳性狀穩(wěn)定并可用于液體深層發(fā)酵的菌種[4]。本文采用傳統(tǒng)的紫外線誘變篩選高產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株，以玉米為原料對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最大產(chǎn)量，節(jié)約生產(chǎn)成本，并為黑龍江省的玉米深加工提供新的途徑，為今后中試或工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)支持，并奠定理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

木醋桿菌（Acetobacter xylinus）Mc-5，黑龍江輕工科學(xué)研究院保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基配方：玉米糖化液2%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%。發(fā)酵培養(yǎng)基配方：玉米糖化液5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，硫酸鎂0.2%。

1.1.3 試劑與儀器

試劑均為分析純，進(jìn)口或國產(chǎn)。

YXQ-SG46-280S手提式高壓滅菌鍋（上海醫(yī)用核子儀器廠）；PY60s恒溫振蕩培養(yǎng)器（武漢匯誠生物科技有限公司）；GT10-1高速離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）；UV2401紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；WS2-134-75培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；PHB-4 pH計(jì)（上海精密儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將從冰箱冷凍保存的菌種轉(zhuǎn)接到種子固體平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)3d，進(jìn)行劃線分離，然后挑取單菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)24h，放置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹5]。

1.2.2 紫外線誘變與篩選

1.2.2.1 誘變

取經(jīng)過0.6u/mL青霉素預(yù)處理1.5h的菌液5mL于離心管中，4 000r/min離心，取上清液，用高滲液洗滌2次，配成高滲菌懸液，加入1.0rag/mL溶菌酶于34℃保溫15.0h，離心洗滌，用高滲液懸浮，制成原生質(zhì)體高滲懸浮液。采用15W紫外燈，距離30cm，照射0～120s，邊攪拌邊照射，力求使菌體均勻吸收紫外線光波。以上照射過程在暗室中進(jìn)行，以免光修復(fù)。將經(jīng)過紫外線誘變后的菌體轉(zhuǎn)入到無菌試管中，并立即浸入冰水中l(wèi).0h。在低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)參與對(duì)突變體修復(fù)的各種酶類活性受到抑制，使修復(fù)難以進(jìn)行，有利于提高突變率[6]。采用夾層法于32℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)，繪制原生質(zhì)體紫外誘變致死率曲線[7]。根據(jù)所獲得的最佳紫外誘變劑量處理高滲菌懸液，然后涂布到平板上進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2.2 篩選

1）發(fā)酵培養(yǎng)。從培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的平板上隨機(jī)挑取50個(gè)單菌落接種到裝有富集培養(yǎng)基的試管中，在28℃培養(yǎng)5d后，挑取10支長膜較好的試管中的菌體用搖瓶進(jìn)行復(fù)篩。將10支試管中的菌株分別接種到盛有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在28℃下培養(yǎng)5d，提取產(chǎn)物，干燥稱重，保存產(chǎn)細(xì)菌纖維素能力較強(qiáng)的菌株。2）纖維素的提取及產(chǎn)量測(cè)定。當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素結(jié)束時(shí)，先將發(fā)酵液在高速離心機(jī)中以3 000r/min的速度高速離心20min后倒掉上清液，取離心沉淀物用4% NaOH溶液在100℃沸水浴中加熱30min去除菌體蛋白，再離心取沉淀，加入適量中性洗滌液在100℃的水浴中加熱1h以除去沉淀物質(zhì)中的雜糖和脂類等雜質(zhì)，然后用去離子水和0.5%乙酸反復(fù)沖洗，最后80℃烘干24h，冷卻至室溫進(jìn)行稱量。3）殘?zhí)菨舛鹊臏y(cè)定。殘?zhí)菨舛鹊臏y(cè)定采用DNS法[8]。4）殘氮濃度的測(cè)定。發(fā)酵液中殘氮的測(cè)定用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法[9]。5）pH的測(cè)定。利用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH值。6）菌種篩選。經(jīng)綜合分析，挑選細(xì)菌纖維素產(chǎn)量高，發(fā)酵液殘?zhí)呛蜌埖康汀a(chǎn)酸較少的菌株。

1.2.3 連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)

將紫外誘變篩選的菌株傳代5次，每代分別進(jìn)行發(fā)酵并檢測(cè)其產(chǎn)細(xì)菌纖維素的量，從而確定最佳發(fā)酵出發(fā)菌株。

1.2.4 細(xì)菌纖維素的提取及產(chǎn)量測(cè)定

當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)細(xì)菌纖維素結(jié)束時(shí)，先將發(fā)酵液在高速離心機(jī)中以3 000r/min的速度高速離心20min后倒掉上清液，取離心沉淀物用4% Na0H溶液在100℃沸水浴中加熱30min去除菌體蛋白，再離心取沉淀，加入適量中性洗滌液在100℃的水浴中加熱1h以除去沉淀物質(zhì)中的雜糖和脂類等雜質(zhì)，然后用去離子水和0.5%乙酸反復(fù)沖洗，最后80℃烘干24h，冷卻至室溫進(jìn)行稱量[10]。

1.2.5 發(fā)酵工藝條件優(yōu)化研究

1.2.5.1 發(fā)酵方法

發(fā)酵在1L三角瓶中進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5.2 氮源及其濃度的確定

1）取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，28℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后使用4%的接種量接入分別以1%酵母膏、蛋白胨、玉米漿為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2）以所確定的氮源按不同的梯度濃度加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后以4%的接種量接入到培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5.3 接種量的確定

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)14h，然后分別以1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%和5.0%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5.4 培養(yǎng)時(shí)間的確定

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)1、2、3、4、5、6d和7d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5.5 培養(yǎng)使用有機(jī)酸的確定

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入添加了0.1%的檸檬酸、醋酸、乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃恒溫振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5.6 單因素實(shí)驗(yàn)分析

1）初始pH對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下恒溫振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入pH分別 為2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在24、27、30、33、36℃和39℃的溫度下振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3）通風(fēng)量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)速50、100、150、200、250r/min和300r/min下振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4）有機(jī)酸對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入添加實(shí)驗(yàn)確定的不同量的有機(jī)酸，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

5）乳酸鹽對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入添加了0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和 0.30%的乳酸鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，提取細(xì)菌纖維素，干燥稱重，比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外誘變篩選結(jié)果

2.1.1 紫外致死曲線

“假設(shè)你參加了一份兼職可獲得100元作為報(bào)酬，但是這份報(bào)酬要延遲1個(gè)月后給你，你認(rèn)為1個(gè)月后，至少給你________元，你會(huì)感到滿意？”被試還需面對(duì)延遲3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的類似情境并進(jìn)行作答(張柏寧，2012)。

采用15W紫外燈，距離30cm，照射0、20、40、60、80、100s和120s，邊攪拌邊照射，力求使菌體均勻吸收紫外線光波。以上照射過程在暗室中進(jìn)行，以免光修復(fù)。將經(jīng)過紫外線誘變后的菌體轉(zhuǎn)入到無菌試管并立即浸入冰水中1h。在低溫條件下，細(xì)胞內(nèi)參與對(duì)突變體修復(fù)的各種酶類活性受到抑制，使修復(fù)難以進(jìn)行，有利于提高突變率。采用夾層法于32℃恒溫箱中培養(yǎng)48h，根據(jù)菌落計(jì)數(shù)，繪制原生質(zhì)體紫外誘變致死率曲線，所得曲線如圖1所示。

圖1 木醋桿菌紫外輻射致死曲線

由圖1可知，隨著時(shí)間的延長，細(xì)菌的致死率增加，當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到120s時(shí)致死率幾乎達(dá)到百分之百。考慮到一般致死率在70.00%～75.00%為宜，故選取照射時(shí)間為80s。

2.1.2 菌株的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量

圖2 紫外誘變優(yōu)選10株木醋桿菌細(xì)菌纖維素產(chǎn)量

從培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的平板上隨機(jī)挑取50個(gè)單菌落接種到裝有富集培養(yǎng)基的試管中，在28℃培養(yǎng)5d后，挑取10支長膜較好的試管中的菌體用搖瓶進(jìn)行復(fù)篩。將10支試管中的菌株分別接種到盛有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在28℃下培養(yǎng)5d，提取產(chǎn)物，干燥稱重，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，10個(gè)菌株的產(chǎn)纖維素能力各異，其中6#、7#、9#號(hào)菌產(chǎn)纖維素能力較強(qiáng)，6#菌株為最強(qiáng)，以其為本組研究菌株。

2.1.3 殘?zhí)菧y(cè)定結(jié)果

如表1所示，殘?zhí)禽^少的發(fā)酵菌株分別為4#、6#、9#，表明這3個(gè)菌株在發(fā)酵過程中對(duì)糖的利用較高，能減少養(yǎng)料的浪費(fèi)。

表1 紫外誘變優(yōu)選10株木醋桿菌發(fā)酵液殘?zhí)呛?/p>

2.1.4 殘氮測(cè)定結(jié)果

如表2所示，殘氮含量較少的菌株分別為1#、6#、9#，同時(shí)也可看出殘氮與殘?zhí)怯写笾碌木€性關(guān)系，這也驗(yàn)證了微生物生長需要一定的C/N比。

表2 紫外誘變優(yōu)選10株木醋桿菌發(fā)酵液殘氮含量

2.1.5 pH測(cè)定結(jié)果

pH的測(cè)定結(jié)果表明的是菌株產(chǎn)醋酸的含量，如果菌株產(chǎn)醋酸含量過高，菌株用于生成纖維素的能量過少，因此，在判斷一個(gè)菌株是否有較高產(chǎn)纖維素潛力時(shí)，應(yīng)考慮其產(chǎn)醋酸的能力。如表3所示，產(chǎn)酸較少的菌株有4#、6#、7#。

表3 紫外誘變優(yōu)選10株木醋桿菌發(fā)酵液最終pH值

2.1.6 篩選結(jié)果

綜合纖維素產(chǎn)量，培養(yǎng)基的殘?zhí)牵瑲埖cpH結(jié)果，可以看到6#菌株的產(chǎn)纖維素含量最高而殘?zhí)恰埖^低，產(chǎn)酸能力也較低，因此是一個(gè)較好的產(chǎn)細(xì)菌纖維素菌株，命名為SW-6。

2.2 連續(xù)傳代實(shí)驗(yàn)

以紫外誘變獲得的菌株SW-6傳代10次，在每次傳代后均進(jìn)行發(fā)酵并檢測(cè)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，由此判斷菌株的遺傳穩(wěn)定性，并根據(jù)遺傳穩(wěn)定性來確定發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

根據(jù)表4的結(jié)果可以看出，SW-6菌株穩(wěn)定，因此選擇SW-6菌株作為發(fā)酵工藝優(yōu)化的出發(fā)菌株。

表4 SW-6菌株5次傳代發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素比較

2.3 發(fā)酵工藝條件的研究

2.3.1 氮源及其濃度

2.3.2.1 氮源的確定

菌種接入分別以1%酵母膏、蛋白胨、玉米漿為氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)5d，進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如圖3所示。

圖3 3種氮源對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

從圖3可以看出，玉米漿對(duì)提高纖維素產(chǎn)量的影響最大。進(jìn)一步研究化學(xué)組成后發(fā)現(xiàn)，玉米漿中含有乳酸鹽，而其他兩種氮源中未含有此成分。作用機(jī)制可能是乳酸鹽參與了TCA循環(huán)，在生長早期乳酸鹽可促進(jìn)代謝流從纖維素合成轉(zhuǎn)向TCA循環(huán)，產(chǎn)生更多能量，加速細(xì)胞生長，從而提高整體的纖維素產(chǎn)量。

2.3.3.2 氮源濃度的確定

如圖4所示，隨著玉米漿濃度的增大，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量逐漸增大，但當(dāng)選擇1.4%的濃度時(shí)，增大的幅度漸趨平緩。基于成本考慮，選擇1.2%作為玉米漿的加入濃度。

圖4 玉米漿濃度對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖5 接種量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.2 接種量的確定

取活化好的菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后分別以不同的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，其發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出，隨著接種量的增加，纖維素的產(chǎn)量也同時(shí)增加。但考慮到今后工業(yè)化生產(chǎn)的工藝安排，如果接種量選擇過大，會(huì)造成種子培養(yǎng)采用多級(jí)放大培養(yǎng)，不僅增加投資，也加大了雜菌污染的機(jī)會(huì)，因此確定接種量為4%。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間的確定

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)l、2、3、4、5、6d和7d，其發(fā)酵結(jié)果如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

從圖6可以看出，纖維素的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，但是發(fā)酵5d后，雖然發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)延長，但纖維素的產(chǎn)量并沒有明顯增加，可以認(rèn)為發(fā)酵結(jié)束。考慮到設(shè)備的利用率，選擇發(fā)酵時(shí)間為5d。

2.3.4 培養(yǎng)使用有機(jī)酸的確定

取活化好的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接入添加了0.1%的檸檬酸、醋酸、乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。

圖7 3種有機(jī)酸對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

2.4.1 初始pH的對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

分別在pH為2.5、3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 和7.5的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，其發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。

圖8 發(fā)酵液初始pH值對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖9 發(fā)酵溫度對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

從圖8可以看出，初始pH對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響情況。培養(yǎng)基pH值在5.0～6.0時(shí)纖維素的產(chǎn)量較高，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中提到細(xì)菌纖維素發(fā)酵產(chǎn)生細(xì)菌的初始pH需要7.0以下相符合，因而確定發(fā)酵初始pH值為6.0。

2.4.2 培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

將活化好SW-6的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，以2%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在24、27、30、33、36℃和39℃的溫度下振蕩培養(yǎng)5d，發(fā)酵結(jié)果如圖9所示。

從圖9可以看出，過高和過低的培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素的產(chǎn)量影響較大，最佳的培養(yǎng)溫度為30℃。

2.4.3 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

取活化好的SW-6斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，30℃下振蕩培養(yǎng)14h，然后以4%的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)，分別在轉(zhuǎn)速50、100、150、200、250r/ min和300r/min下振蕩培養(yǎng)5d，結(jié)果如圖10所示。

圖10 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖11 醋酸濃度對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

從圖10中可以看出，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量有很顯著地影響。在低轉(zhuǎn)速的情況下，纖維素的產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速的加大而提高，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到200r/min，纖維素的產(chǎn)量最高為9.6g/L，隨轉(zhuǎn)速的進(jìn)一步提高，纖維素的產(chǎn)量反而下降。這主要由于隨著轉(zhuǎn)速的增加，剪切力加大，影響了纖維素立體結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致產(chǎn)量下降。

2.4.4 有機(jī)酸對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

從圖11中可以看出，添加有機(jī)酸對(duì)提高纖維素的產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用，其中醋酸的效果最好。因此，對(duì)醋酸的添加量進(jìn)行了進(jìn)一步研究，最終確定醋酸的添加量為0.1%。

2.4.5 乳酸鹽對(duì)纖維素產(chǎn)量的影響

在不同氮源的研究中發(fā)現(xiàn)乳酸鹽對(duì)纖維素的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，因而進(jìn)行了乳酸鹽的添加實(shí)驗(yàn)。以4%的接種量接入添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%的乳酸鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃振蕩培養(yǎng)5d，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示。

圖12 乳酸鹽濃度對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

從圖12可以看出，乳酸鹽對(duì)纖維素的產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用，但添加量達(dá)到0.15%以上，纖維素的產(chǎn)量并沒有明顯的增加。

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論

經(jīng)對(duì)木醋桿菌進(jìn)行紫外誘變和氯化鋰－紫外復(fù)合篩選，獲得了一株細(xì)菌纖維素高產(chǎn)菌SW-6；用玉米糖化液培養(yǎng)木醋桿菌，獲得了比利用傳統(tǒng)培養(yǎng)基更高的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量；單因素分析，確定了木醋桿菌SW-6的最佳產(chǎn)細(xì)菌纖維素的玉米漿濃度為1.2%，接種量為4%，培養(yǎng)時(shí)間5d，使用的有機(jī)酸為醋酸。

3.2 展望

目前，通過誘變方法篩選優(yōu)良菌種是獲得優(yōu)良菌種的一個(gè)快捷、有效的途徑。誘變方法包括物理誘變和化學(xué)誘變。其中，物理誘變中的紫外線誘變是最常用的一種方式。紫外線誘變具有操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢(shì)，但值得注意的是，紫外誘變須在暗處進(jìn)行，以免發(fā)生光修復(fù)。另外，由于微生物正突變率極低，僅0.05%～0.20%，產(chǎn)量提高10%以上突變株一般也只有1/300，所以挑選的菌落愈多，概率就愈高，但工作量也愈大，特別是產(chǎn)物的測(cè)試工作。一個(gè)高產(chǎn)菌株的獲得要經(jīng)過連續(xù)多代累積誘發(fā)才能達(dá)到目的。該實(shí)驗(yàn)以木醋桿菌為生產(chǎn)菌進(jìn)行紫外誘變，通過大量試驗(yàn)篩選出10株優(yōu)勢(shì)菌后再進(jìn)行發(fā)酵測(cè)試，獲得最佳誘變菌種，取得了良好效果。但是，由于試驗(yàn)是在較短的時(shí)間并在實(shí)驗(yàn)室完成的，關(guān)于本菌種的實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量如何和其遺傳穩(wěn)定性如何，還有待進(jìn)一步研究。

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Screening of High Cellulose Producting Acetobacter xylinum and Optimization of Its Fermentation Process

Wang Liang*
(Heilongjiang Vocational College of Biology Science and Technology, Heilongjiang Harbin 150025)

The major problems in bacterial cellulose production in China are high cost, low yield, etc. A perfect strain was obtained through mutation, and the ferment process was optimized using corn syrup as nitrogen source in this study. This study made achievement in improving the bacterial cellulose yield and reducing the fermentation costs, and thus had great significance in theory and application.

Acetobacter xylinum; Mutation; Fermentation

TS201.5

A

2096-0387（2016）02-0020-06

王良（1981-），男，黑龍江綏化人，碩士，講師，研究方向：發(fā)酵工程。