響應面分析法優化蛹蟲草菌糠多糖提取工藝的研究

姜慧明，楊　紅，呂國忠，孫曉東，滕　聰

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116605)

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響應面分析法優化蛹蟲草菌糠多糖提取工藝的研究

姜慧明，楊紅，呂國忠，孫曉東，滕聰

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116605)

以蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)菌糠為材料，進行菌糠多糖提取條件的優化研究。單因素實驗表明，提取溫度、水料比及提取時間均不同程度地影響多糖提取率。根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理對提取溫度、水料比、提取時間進行三因素三水平試驗設計，采用響應面軟件Design-Expert進行處理，獲得蛹蟲草菌糠多糖提取最佳的優化條件。即提取溫度100 ℃，水料比50∶1，提取時間3 h 優化條件下多糖提取率達5.45 %, 多糖提取預測值為5.88 mg·mL-1。建立的模型擬合度較好，可用來對蛹蟲草多糖提取工藝的分析和預測。

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)；菌糠；多糖；響應面分析

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L) Link.)球殼目、麥角菌科、蟲草屬。蛹蟲草多糖具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖等多種生物活性功能[1]。菌糠是食用菌栽培收貨后的培養基剩余物，其中含有豐富的氨基酸、菌類多糖、Fe、Ca 、Zn、Mg等微量元素及一些食用菌生長的代謝產物，是一種可再生利用的生物資源。近年來，對菌糠的利用已經開展了一些有益的探索。如Zhu[2]等從食用菌中篩選抗細菌物質；Williams等[3]利用菌糠發酵制備燃料沼氣；Sochtig等[4-6]利用菌糠加工有機肥用于園藝和食用菌的生產；劉兆偉等[7]成功地利用菌糠生物降解有害物質，借助改性食用菌菌糠吸附重金屬離子，以食用菌菌糠為原料聚合合成多種菌糠基復合高吸水樹脂[8]等。從廢棄菌糠中提取多糖已成為食用菌菌糠的再次開發與利用的研究熱點之一。

本研究選用以大米為主要基質的蛹蟲草菌糠(主要成分大米81.2 %、蠶蛹粉1.8 %、黃豆9.7 %，白糖5.4 %、KH2PO40.8 %、MgSO40.8 %、VB10.3 %)為材料，利用水提法提取蛹蟲草菌糠多糖，并對不同條件下提取的多糖含量進行測定比較。

1　材料與方法

1.1材料

蛹蟲草菌糠采集于大連普蘭店謝屯蛹蟲草種植地。

1.2儀器及試劑

RE-52旋轉蒸發器(上海研承儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；Sorvall Evolution RC高速落地離心機(賽默飛世爾科技); UV 2100紫外可見分光分度計(河南兄弟儀器設備有限公司); DH27-9053A電熱恒溫鼓風干燥箱(上海一恒); HH-S21-6-S水浴鍋(上海市百典儀器廠);PL303電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多); 80目標準篩。

主要試劑為氯仿、三氯甲烷、茚三酮、濃硫酸、蒽酮、正丁醇、葡萄糖、碘液。

1.3方法

1.3.1原料預處理

將蛹蟲草菌糠用木槌打碎至黃豆粒大小，放入鼓風干燥箱中干燥，在50 ℃的條件下烘干至恒重。粉碎機粉碎后再過80目篩，樣品存放至干燥處備用。

1.3.2葡萄糖標準曲線的制作

將100 mg 葡萄糖置于100 mL 容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，以去離子水補至2.0 mL。稱取0.1 g蒽酮至燒杯中，加入80 %濃H2SO4100 mL溶解，搖勻，備用。每只試管中加入蒽酮-濃硫酸試劑6 mL，混勻，靜置冷卻至室溫，沸水浴加熱15 min，迅速置于冰水中冷卻15 min。以空白為對照，在625 nm下測吸光值。以吸光值為縱坐標、標準葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.3蛹蟲草多糖提取條件的優化

在不同提取溫度、時間和水料比處理條件下浸提后，離心獲上清液。將上清液稀釋20倍，取1 mL，加入3 mL蒽酮濃硫酸試劑搖勻，靜置20 min后，在625 nm下測不同處理條件下的吸光值。

1.3.4蛹蟲草多糖的純化

利用Sevage 法[1]對每份多糖溶液做5次去蛋白處理,留上層溶液備用。

加蒸餾水溶解優化條件下獲得的多糖,經5次去蛋白處理后,向獲得的上層溶液中加入4倍體積的95 %乙醇，經醇析過夜沉淀處理獲得多糖；再依次用無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌2次，室溫下干燥后獲得純化的蟲草粗多糖，稱重后計算多糖分離率。

蛋白質檢測方法采用茚三酮法。具體方法：取待檢的多糖溶液1 mL，向其中滴加2～3 滴茚三酮溶液，觀察是否有藍色出現[6]。

1.3.5單因素實驗

提取時間:稱取10 g蛹蟲草菌糠放入250 mL三角瓶中，加去離子水200 mL，搖勻后分別在100 ℃水浴加熱2，3，4，5，6 h，冷卻，6 000 r·min-1離心10 min，獲上清液，稀釋20倍后量取1 mL，再加入蒽酮濃硫酸試劑3 mL，搖勻，室溫下放置20 min，在625 nm下測吸光值，對照標準曲線得多糖含量。

水料比：稱取蛹蟲草菌糠5 g，分別按照10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1水料比(mL·g-1,下同)加去離子水，搖勻后在100 ℃水浴鍋中加熱4 h，測多糖含量。

提取溫度：稱取10 g蛹蟲草菌糠放入250 mL三角瓶中，加入去離子水2 000 mL，搖勻，分別在40，50，60，70，80，90，100 ℃條件下水浴4 h，測多糖含量。

1.3.6正交試驗設計

根據Box-Behnken中心組合試驗設計法，結合三個單因素水平的實驗結果，分別對多糖提取有顯著影響的溫度、水料比、時間的三水平三因素響應面分析方法進行實驗。因素與水平見表1。

表1　響應面實驗因素及水平

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.2.1提取溫度對多糖含量的影響

提取溫度與多糖質量分數的關系如圖1。由圖1可知，多糖質量分數隨著提取溫度的升高而呈現上升趨勢，當提取溫度升至100 ℃時，多糖質量分數達到最高，并趨于平緩。

圖1　提取溫度與多糖質量分數的關系

2.1.2提取時間對多糖含量的影響

提取時間與多糖質量分數的關系如圖2。由圖2可知，依據2.1.1的結果，100 ℃下提取多糖，多糖質量分數隨著提取時間的延長，呈現先高后低的趨勢，當提取時間達到4 h 時，多糖的質量分數達到最高。

圖2　提取時間與多糖質量分數的關系

2.1.3水料比對多糖含量的影響

水料比與多糖質量分數的關系如圖3。由圖3可知，多糖質量分數隨著水比例的增加，呈現先高后低的趨勢，當水料比為40∶1 時多糖質量分數達到最高。

圖3　水料比與多糖質量分數的關系

2.2響應面試驗分析

2.2.1響應面分析蛹蟲草多糖提取方案與結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計法以及溫度、水料比、時間的三水平三因素進行了響應面分析，結果見表2。

表2　響應面分析蛹蟲草菌糠多糖提取工藝方案及結果

2.2.2蛹蟲草多糖提取回歸方程的建立及試驗分析

表3　響應面二次模型及其回歸系數的方差分析結果

2.2.3響應曲面和等高線分析

響應面是根據回歸方程繪制的呈現各試驗因素相互作用關系的三維空間曲面，可以檢驗變量的響應值大小,明確變量的相互關系。根據等高線圖和響應面，觀察擬合響應面的形狀及特點，分析提取時間、溫度和水料比對多糖提取率的影響如圖4、圖5、圖6。

等高線圖可以較直觀地反映各因素對響應值的影響，方便分析各參數之間的相互作用。由圖4可以看出，提取時間和提取溫度交互作用不明顯，等高線沿著X2方向(提取時間)變化較快，而沿X1方向(提取溫度)變化不明顯，在試驗水平下，提取時間較提取溫度對響應值的影響顯著。在提取溫度和水料比的交互作用中，提取溫度(X1)對響應值的影響比水料比(X3)顯著(如圖5)。由圖6可以看出，提取時間與水料比交互作用也不顯著，表現為曲線平滑，在試驗水平下，提取時間和水料比對響應值的影響差異不大。

圖4　提取時間和提取溫度交互作用的響應面和等高線

圖5　提取溫度和水料比交互作用的響應面和等高線

圖6　提取時間和水料比交互作用的響應面和等

3　結　論

通過對蛹蟲草菌糠多糖提取時間、提取溫度、水料比三個單因素試驗設計，并且針對這三個因素水平的響應面進行分析，得到優化的蛹蟲草菌糠多糖的最佳提取工藝為100 ℃， 3 h， 50∶1，此時多糖提取預測值為5.88 mg·mL-1。該優化工藝對蛹蟲草菌糠多糖提取具有一定的實踐指導意義。

[1] XIAO J H, ZHONG J J. Secondary metabolites fromCyrodycepsspecies and their antitum or activity studies [J]. Recent Pat Biotechnol, 2007,1:123-137.

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[7] 劉兆偉, 王凱, 張曉娣, 等. 改性食用菌菌糠對重金屬離子的吸附特性研究[J]. 科技視界, 2013 (16): 19-20.

[8] 程志強. 菌糠基復合高吸水樹脂的制備及性能研究[D]. 長春：吉林大學化工學院, 2013.

(責任編輯鄒永紅)

Extraction Optimizing of Polysaccharide from Waste Materials ofCordycepsmilitarisby Response Surface Analysis Method

JIANG Hui-ming, YANG Hong, LV Guo-zhong, SUN Xiao-dong, TENG Cong

(School of Environment and Resources, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Single-factor experiments and Box-Behnken central composite design were used to optimize the extraction of polysaccharides from waste materials ofCordycepsmilitaris. The single-factor experiment results showed that three factors including the extraction time, water-materials ratio, and extraction temperature of the experiment would affect the extraction degree. According to Box-Behnken central composite design principle, three factors and three levels experiments are designed, and optimal conditions of extraction of polysaccharides are obtained. Response surface processing software Design-Expert was used. Results showed that optimal extraction conditions were temperature of 100 ℃, time of 3 h, water-material ratio of 50∶1. The extraction rate of polysaccharide was 5.45 % and predictive value of polysaccharide was 5.88 mg/mL. The model fit well, which can be used to analyze and predict the extraction process of polysaccharide fromCordycepsmilitaris.

Cordycepsmilitaris; waste material; polysaccharide; response surface analysis

2096-1383(2016)05-0462-04

2016-07-07；最后

2016-07-25

姜慧明(1972-)，男，山東萊陽人，副教授，博士，主要從事化學研究。

楊紅(1978-)，女，遼寧海城人，副教授，博士，主要從事食用菌研究，E-mail：yanghong@dlnu.edu.cn。

S646

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