運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結腸癥中的發病機制*

陳煒馬婉琳謝小紅伍紹國

運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結腸癥中的發病機制*

陳煒①馬婉琳①謝小紅①伍紹國①

目的：運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結腸癥（HD）中的發病機制。方法：選擇2014年1月-2015年12月，17例HD患兒作為病例組；與性別、年齡配對的17例非巨結腸手術患兒作為對照組，收集術中切除腸段，提取RNA并檢測SOX10表達水平。將人多潛能干細胞定向分化為神經崤細胞，構建SOX10 shRNA慢病毒質粒，轉入SOX10 shRNA慢病毒質粒，檢測SOX10基因表達下調后，導入SOX10，再次檢測SOX10基因表達，與對照組相比上調后，觀察神經崤細胞遷移能力。結果：病例組標本檢測，痙攣段、移行段和擴張段SOX10/β-actni灰度值分別為（0.9254±0.2758）、（1.3082±0.0546）、（1.3147±0.0613），對照組為（1.3178±0.0715），痙攣段與正常腸段SOX10/β-actni灰度值比較差異有統計學意義（P<0.05）。移行段、擴張段與痙攣段SOX10/β-actni灰度值比較，差異均有統計學意義（P<0.05），與正常腸段比較差異均無統計學意義（P>0.05）。25μL SOX10 shRNA慢病毒質粒下調SOX10表達下調率為63.7%。加入促遷移因子laminin前，熒光顯微鏡下隨機視野計數結果顯示，神經嵴干細胞數量數為28%。加入后神經嵴干細胞數量數為65%，差異有統計學意義（x2=12.829，P<0.05）。結論：SOX10在正常結腸組織中高表達，但在HD結腸痙攣段呈低表達，同時SOX10表達失調參與HD的發生和發展，運用人多潛能干細胞試驗證實下調SOX10可導致神經崤細胞遷移障礙，而促遷移因子laminin可恢復其遷移能力。

人多潛能干細胞； SOX10； 先天性巨結腸癥； 發病機制

先天性巨結腸癥（Hirschsprung’s disease，HD）又稱先天性腸神經節細胞缺乏癥[1]，臨床表現為小兒直腸或結腸遠端痙攣，出現排便障礙、無法排便，引起腸梗阻，嚴重的可致患兒死亡[2-3]。是一種常見的出生缺陷，發病率為0.02%～0.05%。到目前為止，HD的發病機制尚未完全闡明。有研究對患兒手術切除的發病腸段進行分析發現，神經節較少甚至缺失，使該腸段自主運動能力低下或缺失，從而發生腸畸形和痙攣，因此何種機制出現腸神經節減少或缺失是先天性巨結腸癥發病機制的關鍵[4]。近年來有研究證實，HD患者存在SOX10基因突變，認為SOX10基因是參與腸神經系統發育的重要基因[5]。本研究通過HD結腸對正常結腸組織SOX10mRNA相對表達量的檢測，并運用人多潛能干細胞研究SOX10在先天性巨結腸癥中的發病機制，旨在進一步闡明HD的病因，為治療提供參考，現報告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料 病例組：2014年1月-2015年12月，17例HD患兒手術標本，男13例，女4例，年齡3 d～13個月，平均（4.7±1.4）個月，均為散發性，其中短段型10例，常見型6例，長段型1例，所有病例均無HD家族史，也未合并其他先天性畸形；對照組：以性別、年齡配對選取17例非巨結腸手術患兒正常結腸組織，男13例，女4例，年齡3 d～13個月，平均（4.5±1.2）個月，其中腸套疊腸壞死回結腸吻合術9例，肛門閉鎖行結腸造屢術4例，直腸閉鎖行結腸造屢術4例。兩組患兒年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2納入與排除標準 試驗經本院醫學倫理委員分批準，患兒家屬知情同意愿意接受研究并簽署知情同意書。入選標準：病例組患兒術后病理證實均為HD，對照組患兒術后病理證實均非HD；排除標準：其他先天性消化道畸形史患兒，家族性頑同便秘患兒。

1.3方法

1.3.1主要設備與試劑 電泳儀型瓊脂糖凝膠水平電泳裝置；德國Biometra公司PCR儀；PCR合成儀；SANYO -86 ℃超低溫冰箱；TGL-16G型臺式低速離心機；DK-SD電熱恒溫水槽水浴鍋；ZF型之外透射反射分析儀；Gene GeniuS成像分析系統；SK1311 Trizol RNA抽提試劑盒（美國GIBCO公司）；dNTP mix（美國Genview公司）；random primers（上海Sangon技術服務有限公司）；First-strand buffer（美國Gibeo公司）；Rnasin（美國MBI公司）；β-actin引物（上海Sangon技術服務有限公司）；DNA Marker DL2000bP（鄭州寶信生物科技有限公司）。

1.3.2標本處理 術中立即取病變腸管，選取全層腸壁組織，無菌生理鹽水沖洗標本后，棄去黏膜，無菌生理鹽水再次沖洗標本組織后，置DEPC水消毒過的Ep管中，不用任何試劑固定，立即送-86 ℃恒溫冰箱中保存，并于2周內做RT-PCR分析，以減少RNA降解；病例組所有標本均經術中診斷、術前X線檢查和術后常規組織學檢查。

1.3.3SOX10檢測方法 嚴格按試劑盒說明操作，提高組織總RNA，分別鑒定完整性和純度，計算RNA的 量。RNA量（pg/mL）=OD260×稀 釋倍數×40/2000，再按1OD260=40 μg RNA計算RNA產率。逆轉錄合成cDNA，PCR擴增，最后進行PCR產物電泳分析，分別將5 μLβ-actni PCR、LSOX10PCR產物和1～2 μL上樣緩沖液混勻后注入加樣孔內，電泳約20 min，分析觀察電泳結果并進行灰度掃描，應用Gene GeniuS成像分析系統作半定量分析，以SOX10/β-actni灰度值比表示SOX10mRNA的相對表達量。

1.3.4SOX10對神經崤細胞遷移的調節作用 將人多潛能干細胞定向分化為神經崤細胞，檢測p75和AP2表達，確定定向誘導有效后，制備25 μL SOX10 shRNA慢病毒質粒，轉入SOX10 shRNA慢病毒質，檢測SOX10基因表達下調后，p75/Ret免疫熒光染色標記，計數神經嵴干細胞數量。加入促遷移因子laminin后，再次計數神經嵴干細胞數量。

1.4觀察指標 比較病例組痙攣段、移行段、擴張段和對照組SOX10mRNA的相對表達量。同時觀察25 μL SOX10 shRNA慢病毒質致SOX10基因表達下調率；加入促遷移因子laminin后神經嵴干細胞數量。

1.5統計學處理 采用SPSS 13.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（±s）表示，比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用x2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1SOX10mRNA相對表達量比較 病例組痙攣段與正常腸段SOX10/β-actni灰度值比較，差異有統計學意義（P<0.05）。病例組移行段、擴張段與痙攣段SOX10/β-actni灰度值比較，差異均有統計學意義（P<0.05），與正常腸段比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1　兩組SOX10mRNA相對表達量比較（±s）

表1　兩組SOX10mRNA相對表達量比較（±s）

*與痙攣段比較，P<0.05

SOX10/β-actni灰度值痙攣段　移行段　擴張段　正常腸段病例組（n=17）　0.9254±0.2758　1.3082±0.0546*1.3147±0.0613*-對照組（n=17）　-　-　-　1.3178±0.0715 t值　16.204　1.207　0.568　-P值　0.000　0.093　0.647　-組別

2.2SOX10 shRNA慢病毒質對SOX10下調率的影響 25Μl SOX10 shRNA慢病毒質粒下調SOX10表達下調率為63.7%。

2.3加入促遷移因子laminin前后神經嵴干細胞數量觀察 加入促遷移因子laminin前，熒光顯微鏡下隨機視野計數結果顯示，神經嵴干細胞數量數為28%。加入后神經嵴干細胞數量數為65%，差異有統計學意義（x2=12.829，P<0.05）。

3　討論

腸神經系統（enteric nervous system，ENS）由神經節細胞、致密的神經纖維和特殊的膠質細胞組成，神經纖維連接各神經節細胞，構成完整的調節系統[6-10]，具有獨立控制胃腸蠕動，調節消化道吸收和分泌的重要功能。ENS源于神經崤細胞巢，在胚胎發育早期，神經管閉合后，其雙側細胞帶發育成神經崤，當神經崤發育到一定階段，從神經管分離出來后，神經崤細胞開始向下遷移，部分細胞逐漸下降至咽囊段和軀干部，繼而遷移至各大臟器，最終定位于胚胎某一部位，形成神經節細胞。因此推測先天性巨結腸癥（Hirschsprung’s disease，HD）的發病原因可能是神經崤細胞在遷移和定位中受腸管微環境諸多因素的影響，出現遷移障礙，致神經崤無法下降至大腸末端而致發病腸段神經節細胞缺失，發生HD[11-13]。

DomSOX10是雜合子動物中產生致死性ENS表型的唯一被認識的基因突變。目前多數觀察認為HD腸神經系統神經節細胞缺失的原因是環境和遺傳因素共同作用的結果[14]。近年來隨著分子生物學技術的發展，己明確HD腸神經系統神經節細胞缺失與多種基因密切相關[15]。SOX10屬SOX家族，位于染色體22q13，參與細胞定向分化，干性維持和組織形成等，是一族進化過程中高度保守的基因，在神經嵴、oligodendrocyte細胞、Schwann細胞和外周神經系統的形成、成熟和終末分化中均發揮了重要作用，而SOX10突變可導致腸神經系統發育異常。同時國外研究證實，SOX10的未成熟終止突變可引起神經崤細胞衍生物表達缺失，他們認為SOX10可能是不與其他易患基因相關的侯選突變位點[16-17]。動物實驗研究已證實，缺乏SOX10小鼠腸神經系統發育停頓，表明小鼠SOX10基因中單個堿基的插入是突變體巨結腸表型的主要原因，并推測可能是突變的神經崤細胞在其移行中早期過量死亡所致[18-19]。目前已證實人類嚴重的SOX10突變可導致HD、瓦爾敦堡綜合征個體及耳聾，提示其可能參與了調節突變的神經崤細胞的早期發育和信號途徑，使其分化為腸神經節細胞和黑色素細胞[12]。

Sham等[20]檢測了sox10在HD結腸和正常結腸中的表達，結果發現，正常結腸中的表達明顯高于HD結腸。本研究結果顯示，病例組標本痙攣段SOX10/β-actni灰度值為（0.9254±0.2758），明顯低于移行段、擴張段和正常腸段，差異均有統計學意義（P<0.05），與Sham等[20]研究相符。說明在HD結腸段SOX10mRNA呈低表達，同時也說明SOX10基因不僅在胚胎時間對腸神經系統產生影響，其在出生后也是維持腸神經系統正常功能所必須的，一旦表達減少，則可能引起腸管痙攣，造成功能障礙。運用人多潛能干細胞，定向分化為神經崤細胞，轉入SOX10 shRNA慢病毒質后，SOX10表達率下降達63.7%，加入促遷移因子laminin前后，神經嵴干細胞數量比較差異有統計學意義（P<0.05）。說明SOX10在正常結腸組織中高表達，但在HD結腸痙攣段呈低表達。同時SOX10表達失調參與HD的發生和發展，運用人多潛能干細胞試驗證實下調SOX10可導致神經崤細胞遷移障礙，而促遷移因子laminin可恢復其遷移能力。

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Using Human SOX10 Pluripotent Stem Cell Research in the Pathogenesis of Hirschsprung’s Disease

CHEN Wei，MA Wan-lin，XIE Xiao-hong，et al.

Medical Innovation of China，2016，13（24）：010-013

Objective：To apply SOX10 human pluripotent stem cell research in the pathogenesis of hirschsprung’s disease（HD）.Method：From January 2014 to December 2015，17 cases children with HD as a group.By gender，age，matching of 17 cases of children with hirschsprung surgery as the control group，collection of excision of the intestine， extracting RNA and detecting SOX10 expression level.Human pluripotentstem cells，directional differentiation into neural xiaohan cells， build SOX10 shRNA lentivirus plasmid，into SOX10 shRNA lentivirus plasmid，detect SOX10 gene expression after the downgrade，import SOX10，again to detect SOX10 gene expression，compared with the control group after raising，ability to observe neural xiaohan cell migration.Result：CPT samples，spas m，transitional period and the expansion period of SOX10/beta actni grey value were respectively （0.9254±0.2758），（1.3082±0.0546），（1.3147±0.0613） and the control group was （1.3178±0.0715），convulsion period and normal bowel SOX10/beta actni grey value comparison difference was statistically significant（P<0.05）.Transitional period，expanding period and spasm SOX10/beta actni grey value comparison difference was statistically significant（P<0.05）.There was no statistically significant difference compared with normal bowel（P>0.05）.25 μL SOX10 shRNA lentivirus cut SOX10 expression plasmid cut rate was 63.7%.Before joining migration factors laminin，fluorescence microscope counting random field of vision，according to the results of neural crest stem cell number count was 28%.After joining neural crest stem cell number count was 65%，the difference was statistically significant（x2=12.829，P<0.05）.Conclusion：SOX10 in normal colon tissue increases，but lower expression in HD colon spasms segment，the imbalance in SOX10 expresses the occurrence and development of HD，experiment using human pluripotent stem cells confirmed by SOX10 can cause nerve xiaohan cell migration barriers，and promote migration factor laminin can restore its ability to migrate.

Human pluripotent stem cells； SOX10； Congenital hirschsprung disease；Pathogenesis

10.3969/j.issn.1674-4985.2016.24.003

2016-05-06） （本文編輯：程旭然）

廣東省醫學科學技術研究基金（WST JJ20140610430105198106043011）

①廣州市第十二人民醫院 廣東 廣州 510000

陳煒

First-author’s address：The Twelfth People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510000，China