豬流行性腹瀉病毒的特性研究

王靚靚，張?艷，白會新?

（1.?大慶市畜牧獸醫局，黑龍江?大慶?163311；2.黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江??齊齊哈爾??161000）

豬流行性腹瀉病毒的特性研究

王靚靚1，張?艷2，白會新1

（1.?大慶市畜牧獸醫局，黑龍江?大慶?163311；2.黑龍江省獸醫科學研究所，黑龍江??齊齊哈爾??161000）

豬流行性腹瀉（porcine?epidemic?diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV）?引起的一種嚴重的病毒性傳染病。對于大多數的病毒性腹瀉疾病來說，防治措施一般選擇疫苗免疫。近年來，有關豬流行性腹瀉病毒疫苗的研究已經取得了一定的進展，包括滅活疫苗、弱毒疫苗、轉基因植物疫苗、乳酸桿菌疫苗、亞單位疫苗和聯合疫苗等。實驗參照2010年版《中華人民共和國獸藥典》第3部的要求對該病毒的特性進行了系統研究與記錄，為PEDV?HLJBX株可作為弱毒疫苗候選株的研究提供了進一步的參考資料。

豬流行性腹瀉病毒；種毒；疫苗

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）?引起的一種嚴重的病毒性傳染病。該病的特征是可以導致哺乳仔豬發生嚴重的腹瀉、嘔吐、脫水，并且致死率極高。實驗室常用微量血清中和試驗［1］、免疫電鏡法（IEM）［2］、免疫熒光法（FAT）［3］、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）［4］、雙抗體夾心ELISA［5］、反轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）［6］和RT-LAMP技術［7］等技術手段檢測該病。本文參照《中華人民共和國獸藥典》2010年版第3部的要求，通過對PEDV?HLJBX毒株的純粹檢查、滴度的測定和理化特性等生物學特性進行研究記錄，為下一步疫苗開發奠定基礎。

1　試驗材料

1.1毒株、細胞系和引物

PEDV?HLJBX株由東北農業大學預防獸醫學實驗室分離并保存，非洲綠猴傳代腎細胞（Vero）細胞系本實驗室保存。豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬輪狀病毒（PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）、豬圓環病毒（PCV）鑒定引物均由東北農業大學預防獸醫學實驗室設計并由博仕生物公司合成。

1.2試劑

DMEM培養液，犢牛血清，RNA提取試劑盒，PEDV陽性血清，鼠抗PEDV全病毒抗體，FITC標記的羊抗鼠酶標抗體，葡萄糖蛋白胨培養基（G.P）、硫乙醇酸鹽培養基（TG）和支原體培養基均由本實驗室配制。

2?　實驗方法

2.1種毒的純粹檢查

2.1.1無菌檢測

在已經配好的硫乙醇酸鹽培養基（T.G）和葡萄糖蛋白胨培養基（G.P）中接種PEDV，每種培養基各接2只試管，每管l?mL。分別置于37?℃和25?℃條件下培養7?d，對照管接種無菌生理鹽水。每天觀察記錄結果。

2.1.2支原體檢測

在支原體半流體培養基和肉湯培養基中接種PEDV種毒，每種培養基接種4支，每支0.5?mL。置?37℃培養14?d，每3?d觀察一次，陰性對照為生理鹽水，陽性對照為肺炎支原體。

2.1.3外源病毒檢驗

按照提取總RNA和DNA試劑盒的說明提取種毒液的RNA和DNA，將提取的RNA反轉錄為cDNA，將反轉錄的產物使用豬輪狀病毒（PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖和呼吸障礙綜合征病毒（PRRSV）、豬細小病毒（PPV）和豬圓環病毒（PCV）相應上、下游引物及反應條件進行PCR擴增。反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2.2種毒的理化特性

2.2.1熱穩定性實驗

取5管PEDV病毒，離心去細胞碎片，一管作為對照組放于4?℃，?保存30?min，其余4管分別置于37?℃、42?℃、50?℃、65?℃，30?min水浴，然后把實驗組和對照組均接種在長滿Vero細胞的96孔板中進行TCID50測定。

2.2.2pH穩定性實驗取2管PEDV，一管作為對照組，

另一管用HCl調至pH=3，37?℃作用1?h后，再調回pH為7.2～7.4，將對照組和實驗組分別接種在長滿Vero細胞的96孔板中，進行TCID50測定。

2.2.3氯仿敏感性實驗

取2管PEDV，一管加入氯仿，使其終濃度為4.8%，振蕩混勻，2?500?r/?min離心5?min，取上清，另一管加DMEM作對照，測定兩組病毒的TCID50。

2.3種毒滴度的測定

采用96孔板進行測定。首先將細胞進行消化，分裝到96孔板內，待細胞長滿80%時，棄去DMEM液，用PBS洗3次，將病毒稀釋成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9，10-1010個稀釋度，每一稀釋度接種5孔細胞，接種量為100?μL/孔，并設立一行作為細胞對照，在接毒后72?h，判定細胞病變，當病變細胞在80%以上時，判定為病變細胞孔，進行TCID50的測定。按公式計算（Reed-Muech?氏法計算）。

表1　細菌和霉菌檢測結果

表2　PEDV支原體檢測結果

病毒稀釋度　孔數　　無CPE孔數有CPE孔數　　累計總數　CPE孔比例　　出現CPE率/% 無CPE孔　　有CPE孔10-1　5　0　5　0　28　28/28　100 10-2　5　0　5　0　23　23/23　100 10-3　5　0　5　0　18　18/18　100 10-4　5　0　5　0　13　13/13　100 10-5　5　0　5　0　8　8/8　100 10-6　5　2　3　2　3　3/5　60 10-7　5　5　0　7　0　0/7　0 10-8　5　5　0　12　0　0/12　0 10-9　5　5　0　17　0　0/17　0 10-10　5　5　0　22　0　0/22　0接種細胞

3　結果與分析

3.1細菌和霉菌檢測結果

對PEDV種毒進行檢測，未見細菌、霉菌污染（見表1）。

3.2支原體檢測結果

用以下2種培養基對PEDV種毒進行檢測，均未見支原體污染（見表2）。

3.3外源病毒檢測結果

對PRV、PRRSV、TEGV、PPV 和PCV的檢測結果，全部呈陰性，證明PEDV沒有這幾種外源病毒的污染（見圖1）。

3.4理化特性結果

3.4.2熱穩定性實驗結果

病毒在50?℃及以上溫度處理30?min就會失去感染細胞的能力，滴度大幅度下降，而37?℃下作用30?min對病毒滴度沒有影響（見圖2）。

3.4.2pH穩定性實驗

將PEDV的pH調至3時，病毒的滴度變化不大，說明PEDV的PH較為穩定（見圖3）。

圖1　外源病毒的檢測

圖2　PEDV熱穩定性實驗

圖4　PEDV的氯仿敏感性實驗

3.4.3氯仿敏感性實驗

加入終濃度為4.8%的氯仿，實驗組的TCID50與對照組的對數差值大于2，表明PEDV對氯仿敏感（見圖4）。

3.5種毒庫病毒滴度的測定

采用96孔板進行測定，在接毒后72?h，判定細胞病變，當病變細胞在80%以上時，判定為病變細胞孔，進行TCID50的測定。按公式計算（Reed-Muech?氏法計算），結果見表3。

其確切稀釋倍數可按下列公式計算：

將由上式獲得的0.17加在高于?50%死亡的稀釋度的對數（6）上，因此該病毒的?TCID50應是10-6.17/0.1?mL。

4　討論

隨著PED在許多國家的暴發，很多國內外學者都一直在研究PEDV的培養特性，希望可以通過PEDV的體外培養和PEDV感染細胞受體等多方面的研究來進行PEDV的大量繁殖，可以為PEDV的疫苗研制提供重要的物質基礎。有報道稱適應細胞培養的PEDV 經60?℃或以上處理30?min失去感染力，但在50℃條件下相對穩定，病毒在4?℃、pH?5.0～9.0以 及37?℃、pH?6.5～7.5時穩定，經超聲波處理或多次反復凍融后，病毒感染力不受影響，這些都與本實驗結果相符。Kusanagi等［8］報道PEDV?對乙醇和氯仿敏感。這些研究成果只是一部分PEDV毒株的理化特性，并沒有針對性。本實驗通過對PEDV?HLJBX毒株的理化特性的研究顯示，PEDV對熱敏感，若在50?℃溫度下作用30?min，就會失去了感染力，可達到熱滅活的效果。pH穩定性試驗顯示，病毒的滴度變化不大。

［1］?鄧芳.豬流行性腹瀉預防及診斷研究進展［J］.畜禽業，2015?（3）：19-20.

［2］?照日格圖，李志國，王振普.?豬流行性腹瀉的診斷技術及預防策略［J］.北方牧業，2013?（13）：18.

［3］?林志雄，黃引賢，李樹根，等.應用直接免疫熒光法檢測豬流行性腹瀉病毒的研究［J］.中國進出境動植檢，1997?（2）：32-34.

［4］?華耀，王瑋，李郁，等.?豬流行性腹瀉病毒S蛋白主要抗原表位區的原核表達及間接ELISA檢測方法的建立［J］.?微生物學通報，2016，43（2）：434-443.

［5］?李一經，劉博，姜艷平，等.?雙抗體夾心ELISA檢測排泄物PEDV［J］.?東北農業大學學報，2015，46（2）：1-10.

［6］?孟凡偉，張雪，王俊，等.?豬流行性腹瀉病毒Real-time?PCR檢測方法的建立［J］.中國農學通報，2014，30（5）：41-45.

［7］?LI?PREN?X.Reverse?transcription?loop-mediated?isothermal?amplification?for?rapid?detection?of?transmissible?gastroenteritis?virus［J］.Curr?Microbiol，2011，62（3）：1074-1080.

［8］?KUSANAGI?K，KUWAHARAR?H，KATOH?T，et?al.Isolation?and?serial?propagation?of?porcine?epidemic?diarrhea?virus?in?cell?cultures?and?partial?characterization?of?the?isolate［J］.Vet?Med?Sci，1992，54（2）：313-318.

2016-04-08）

黑龍江省教育廳新世紀優秀人才基金資助項目（1155-NCET-005）；黑龍江省高校科技創新團隊基

金資助項目（2011TD001）；國家自然科學基金資助項目（31201911；31200122）

王靚靚（1987-），女，獸醫碩士，獸醫師，主要從事工作：動物衛生監督和疫病防控

白會新