CRISPR/Cas9系統的研究進展及其在水稻上的應用

彭亞瓊，陳光輝，李懿星，李 莉*

(1.衡陽市農業科學研究所，湖南衡陽 421101； 2.湖南農業大學農學院，湖南長沙 410128；3.湖南省雜交水稻研究中心，湖南長沙 410125)

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CRISPR/Cas9系統的研究進展及其在水稻上的應用

彭亞瓊1，陳光輝2，李懿星3，李 莉3*

(1.衡陽市農業科學研究所，湖南衡陽 421101； 2.湖南農業大學農學院，湖南長沙 410128；3.湖南省雜交水稻研究中心，湖南長沙 410125)

綜述了CRISPR/Cas9系統的結構、定點突變原理、載體構建類型及介導突變的可遺傳性，著重分析了影響突變效率的因素，介紹該系統目前在水稻上的研究，并展望其應用前景。

CRISPR/Cas9；基因組編輯；基因打靶；水稻

在自然選擇的壓力下，水稻個體優勝劣汰，適應環境且性狀優良的野生水稻品種相對較少，難以滿足人們對水稻多樣性的需求。對水稻誘變材料進行精細定位，獲得控制優良性狀的突變基因，為實際運用奠定理論基礎；同時將性狀優良的突變材料大量繁殖，以作為優良親本推廣運用。然而誘變突變的產生是隨機性的、無方向性的，突變概率較低，且難以集中多個理想性狀。因此，育種家常為獲得一個理想單株/個體需經過多次突變、多次選擇，存在浪費人力和物力的風險，如突變體的表型可能由環境引起，其優良性狀無法遺傳等。隨著近年來各國的交流和探索，嘗試利用定點編輯基因序列反向研究基因的功能。鋅指核酸酶(zinc finger nucleases，ZFn)、轉錄激活因子樣效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)和規律性重復短回文序列簇(clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPRs)等可靠、高效且準確的基因組編輯技術相繼出現，縮短了獲得突變體的時間，加快了基因功能研究的步伐。

目前，ZFn技術的運用具有明顯的局限性，對編輯的目的序列有嚴格要求，識別的結構域存在很強的上下文依賴效應，難以實現對任意序列設計出滿足要求的打靶位點。即使設計出打靶位點，若無高特異性、高親和性的鋅指蛋白與其結合，也易出現脫靶現象[1]。篩選合適的鋅指蛋白也需要龐大的鋅指蛋白表達文庫做支撐。因此，ZFn技術存在操作繁瑣、工作量大、花費高昂等一系列問題。ZFn的脫靶切割對細胞有一定毒性，導致ZFn技術無法滿足人們準確且快速編輯基因的要求，因此，選擇合適的調控方式來降低脫靶切割是ZFn技術亟待解決的一個難題。與ZFn技術相比，TALENs技術靶點設計要求低，打靶位點選擇較多，但TALENs技術也存在弊端，如載體構建繁瑣，難度大，重組率低，周期長，成本高，且一旦脫靶，易對受體細胞產生毒性，這 限制了7ALENS技術進一步運用。

相較于人工核酸酶技術ZFn和TALEN，CRISPR/Cas9系統是天然存在的原核生物RNA干擾系統，對物種及序列無選擇性，對打靶位點序列要求低，打靶效率較高，操作簡單，周期短，成本低。通過CRISPR/Cas9系統獲得突變體，多為單個堿基插入類型的突變體或幾個堿基缺失類型的突變體，也存在小概率的6～100 bp的片段缺失突變體。CRISPR/Cas9系統能較快、準確地產生理想突變體，大大加快基因功能研究的進程。2013年，CRISPR/Cas9系統被Science雜志評為排名第一的十大突破技術[2]，現已成為近年來基因編輯的首選手段。筆者綜述了CRISPR/Cas9系統的結構、定點突變原理、載體構建類型及介導突變的可遺傳性，分析了影響突變效率的因素，并展望了其應用前景。

1　CRISPR/Cas9系統的結構

CRISPR/Cas9系統的基本結構由切割域和結合域2部分組成。切割域位于結合域上游，主要原件為Cas基因，編碼的蛋白具核酸相關功能，與Folk酶功能相似，即通過識別特異性位點切斷入侵DNA，從而降解外來基因序列。Cas基因也參與CRISPR的轉錄、加工等過程。結合域主要包括位于上游的前導序列和位于下游的CRISPR位點。前導序列一般有300～500 bp，富含AT結構，可作為啟動子，啟動CRISPR序列的轉錄，產生非編碼RNA(crRNA)。CRISPR位點主要由重復序列和間隔序列組成，以重復序列開始，以重復序列結束，且以2個重復序列之間穿插一個間隔序列的模式排列，因此，間隔序列的數量始終比重復序列少1個。不同物種擁有的重復序列個數不同，一般而言，重復序列的堿基個數為21～48個，具5～7 bp的回文序列，高度保守，間隔序列的堿基個數為2 672個。在已測序的細菌中，有40%的細菌其基因組存在CRISPR位點，進一步觀察發現，CRISPR位點存在于細胞染色體上，極少部分存在于質粒中[3]。

2　CRISPR/Cas9系統定點突變的原理

1987年，研究者對大腸桿菌12K的iap基因進行研究，結果發現，CRISPR/Cas9系統在iap基因側翼以成群的短回文重復序列存在，經試驗證明，這些簡單重復序列與很多病毒或質粒的DNA序列互補，2年，推斷細菌中的CRISPR/Cas9系統是抵抗病毒入侵的一種免疫機制[4]。

CRISPR系統有I、II及III 3種類型，其中，I型和III型需要crRNA和多種Cas蛋白共同發揮作用才能順利剪切外源DNA，而II型僅需要crRNA、tracrRNA和Cas9相互協作即可降解外源DNA，總體上，II型相對于I型和III型要求較低。截至目前，II型研究最透徹，運用最廣泛[5]。

圖1　II型CRISPR/Cas9結構示意Fig.1　Type II CRISPR/Cas9 structure diagram

根據細菌免疫抵抗外界病毒侵染的原理，構建了具CRISPR/Cas9系統的空載體。當需要定點編輯基因組序列時，將設計的目的片段連入空載體，形成最終打靶載體后，通過轉化整合到受體基因組上發揮編輯作用。為簡化實際操作，即用幾個堿基將crRNA與tracrRNA連接起來，形成具發卡結構的回文序列，稱之為SgRNA。改良的SgRNA-Cas9系統更容易完成基因靶向修飾。將連有目的片段的SgRNA-Cas9載體轉入并整合到小鼠[7]、斑馬魚[8]、果蠅[9]、擬南芥[10]、煙草[11]、水稻[12]等物種的基因組上，利用轉錄的crRNA和tracrRNA進行互補配對形成雙鏈，再與Cas蛋白組成復合體，通過復合體識別并剪切基因組，導致雙鏈斷裂。在雙鏈修復過程中將產生突變，有如下2種突變類型：一是無同源片段存在，雙鏈末端自身連接。與正常基因序列相比，不僅缺少被剪切的基因序列，且連接處也易發生堿基突變，導致編碼的蛋白發生變化，最終可能引起基因功能發生變化；二是同源片段存在，堿基互補配對修復。若人為干擾加入同源片段，斷裂處能根據同源片段序列通過堿基配對來修復，最終達到插入基因的目的。

通常CRISPR/Cas9系統只切割PAM(即NGG)前的3 bp，在無同源片段進行修復的情況下，產生突變的位置在切口附近[11]。研究表明，靠近5′端且處于目標序列一半的位置，發生單堿基突變的頻率較高[13-14]。

3　CRISPR/Cas9系統的構建類型

相比TALENs載體構建，CRISPR/Cas9載體的構建方法簡單較易，只需將設計的靶位點序列進行退火，再連入載體即可。根據最終打靶載體的不同，載體構建有細微的差別。

常見的最終打靶載體有3種類型：第一種是2個最終打靶載體，一個含有目的基因序列，行使識別功能，一個含有Cas9，行使切割功能。此類型需要2個載體均發揮其應有的功能才能打靶成功。構建時，需將目的靶位點序列進行退火，再連入識別目的基因的載體，含Cas9的載體無需改變；第二種是一個最終打靶載體，載體既包含識別目的基因序列的原件，又包括行使切割功能的Cas9原件。且識別目的基因的原件由一個啟動子啟動，可連接一個目的打靶位點序列。打靶時類似于單酶切，能導致某一處DNA雙鏈發生斷裂。第三種也是一個最終打靶載體，與第二種類似，但識別目的基因序列的原件包含2個啟動子，每個啟動子都可以連接一個目的打靶位點序列。打靶時類似于雙酶切，能造成2處DNA雙鏈的斷裂，在DNA修復過程中，2切口之間的小片段可能被自身降解，最終造成一段序列的缺失，突變幾率大大提高。若采用第三種打靶載體來編輯基因，其目的基因的序列應為5′-CCN-N20-N(若干個)-N20-NGG-3′，其中N為任意堿基，若士個n處于-2 ～30，其打靶效率較高[15]。

各CRISPR/Cas9打靶載體不同，其打靶效率也不同。第一種需2個載體共同作用才能產生突變，而第二、三種僅一個載體發揮作用即可，因此，理論上第一種效率較低，在植物方面的應用已逐漸被淘汰。第二種常產生1 bp突變，可能導致編碼的蛋白不變，相應的功能也未發生變化。而與第二種相比，第三種更易產生大片段的缺失，導致移碼突變，獲得突變體，且表型突變的可能性較大。但第三種對打靶序列要求相對較高，因此，應用具有局限性。

4　影響CRISPR/Cas9系統突變效率的因素

4.1CRISPR/Cas9空載體的影響CRISPR/Cas9系統在發展與進步，空載體在運用過程中得到改良，不同人改造的原件不同，改造的序列不同，改造前與改造后，載體進入植物體內，能整合到基因組上并發揮作用的效率不同，最終對植物基因的打靶效率也不同[16]。且改造后的不同載體對目的序列的設計要求也不同，如水稻打靶載體的啟動子有U3、U6、T7及CaMV35[17]。打靶載體若是以U6作為啟動子，要想獲得較高的打靶效率，則打靶目的片段5′端的第一個堿基必須為G[18-19]，即5′-GN19NGG-3′。若以T7作為啟動子，則打靶目的片段5′端的前2個堿基必須為(G/A)(G/A)，即5′-(G/A)(G/A)N18NGG-3′[19]。

4.2打靶位點的影響

目前各院校推行的“現代學徒制”不僅限于訂單式培養，工學結合頂崗實習等模式內容，但基本都在強調“在做中學”“在學中做”。“學徒”部分時間在實際生產服務一線崗位上，以“師傅帶徒弟”的方式接受訓練，部分時間學習必要的文化和專業理論知識，以期迅速成長為職業資格證書、職業教育學歷證書雙手握的高技能應用型人才，并在一定程度上解決企業招工難，成長難等問題。為企業穩定了職工隊伍，創造了利潤，同時培養年輕人對職業與企業的認同與歸屬感。

4.2.1相似。CRISPR/Cas9系統識別序列僅由20 bp組成，而在龐大的基因組序列中，存在較多與20 bp相似的序列。在CRISPR/Cas9系統識別目的基因序列過程中，可能發生錯配現象，導致復合體與目標位置外的基因序列結合。與遠離PAM端發生錯配的情況相比，臨近PAM端的堿基發生錯配時對Cas9蛋白的切割能力影響較大，易發生脫靶現象[20]。因此，為降低脫靶率，設計的目的靶位點最好是唯一的，若找不到唯一，設計的目的序列應盡量避免植物基因組中存在與近PAM端同源的序列。

4.2.2長度。 目標打靶序列的長短對目標切割效應和低脫靶效應有影響。研究表明，縮短目標序列的長度能提高靶位點的識別準確度，從而減弱脫靶效應，但在一定程度上降低了對目的基因的切割能力[21]。因此，找到目標切割效應和低脫靶效應的平衡點，設置最佳目標序列長度，才能產生最佳的打靶突變效果。目前廣泛應用的是將PAM(即NGG)前20個堿基做為目標序列。在這20 bp中，位于PAM上游的12個堿基對打靶突變起決定性作用[20]。

4.2.3位置。 大小為20 bp的目標序列，其位置不同，能被切割產生突變的概率也不同。如目的打靶位點設在非編碼區，即使發生突變，也不能引起植物編碼蛋白質的變化，自然植物的功能未發生改變，使試驗無研究意義，只有目的打靶位點設在CDS區域，才能產生有意義的表型突變；如打靶位點處于第一個外顯子，較第二個外顯子更能引起蛋白的變化，產生較理想的突變[22]；如靶位點靠近C′端，打靶效率低，即使靶位點有個別堿基發生變化，但處于編碼蛋白將要結束的位置，較難打亂蛋白正常表達，最終不能引起表型及功能的變化[22]。

4.2.4序列。 有些序列易被CRISPR/Cas9系統打靶成功，而有些卻很難被切割產生雙鏈斷裂。如打靶序列的重復序列高、GC含量太高或太低，其打靶效率均偏低[23]，為得到理想的打靶效率，目標序列的GC含量應控制在20%～80%[24]。

目的打靶序列常設為5′-N20NGG-3′(N為任意堿基)。在組成NGG前的20 bp中，四類堿基排列順序不同，其打靶效率相差較大。研究發現，最影響打靶效率的是5′端第16、20位的堿基，第16位為A或C堿基，能大大提高打靶效率，特別是C堿基，若為G堿基則打靶效率大大降低；第20位若為A或G堿基，能大大提高打靶效率，特別是C堿基，若為G堿基則打靶效率大大降低；PAM(即NGG)中的N適合選擇G或C堿基，不宜選T堿基，且處于NGG下游，緊鄰NGG的第一個堿基對打靶效果影響大，若為堿基G，易造成脫靶，因此，打靶最佳組合為CGG加T堿基，最不適宜組合為TGG加G堿基[22]。

4.3載體濃度在菌液轉化受體材料的過程中，菌液體積一定，菌液所含打靶載體濃度大，最終導入植物中的打靶載體多，可成功打靶的概率高；相反，菌液所含打靶載體濃度小，成功打靶的概率較低。但打靶載體的濃度太高，也易起反作用，導致打靶位點在目標序列之外，常出現目標序列附近被Cas9切開。至目前為止，暫時尚未有明確的打靶載體適宜濃度[25]。

4.4愈傷時期愈傷組織將經歷一個從對數生長到穩定再到衰亡的過程。對處于衰亡期的愈傷組織進行打靶，其能吸收營養并加以利用的能力差，分裂速度慢，經篩選、分化后，大部分走向死亡，可獲得的幼苗少，自然獲得陽性植株數量少，打靶成功的幾率更小。相反，對處于對數增長期的愈傷組織進行打靶，恢復活力快，長成幼苗的較多，獲得陽性植株數量較多，打靶成功的幾率相對較高。而對處于穩定期愈傷組織的打靶成功率介于衰亡期和對數期之間。

5　CRISPR/Cas9系統介導突變的可遺傳性

CRISPR/Cas9系統在動物上的應用非常廣泛，常以動物胚胎干細胞作為受體細胞，以致在當代獲得突變純合子相對較高。然而植物不同于動物，經CRISPR/Cas9系統打靶產生的突變自然不同[10]。

CRISPR/Cas9系統介導的突變常發生在T0代植株的體細胞中，因此，T0代植株中存在突變純合子的概率較低，主要出現的是野生型植株、突變雜合子植株、嵌合體植株(即在一植株的打靶位點處，PCR檢測發現有3條或3條以上不同的序列，含野生型序列)及雙等位基因植株4種類型，但在突變率較高的情況下，在T0代有可能出現純合子突變[10，26-27]。

T1代植株除T0代的4種類型外，還存在突變純合子植株。T0代純合子遺傳穩定，即使突變植株較野生型植株僅發生1 bp的變化，CRISPR/Cas9系統中具核酸內切酶作用的Cas9也不能在突變植株已發生突變的位置再次切割其基因雙鏈序列，因此，在正常栽培條件下不會發生突變；T1代雜合子突變體的后代其分離比基本遵循孟德爾遺傳定律1∶2∶1，但也存在發生新突變植株的情況，如以嵌合體形式出現的突變植株，嵌合體植株再將已產生的1個、2個或者0個突變傳遞到后代；T0代野生型傳至T1代時，因被自身攜帶的CRISPR/Cas9系統切割其雙鏈DNA，最終能產生T0代沒有的新突變，但傳至T2代，大部分植株不再產生新突變，即CRISPR/Cas9系統很難對其已產生突變的植株再次產生突變[10，26-27]。

6　CRISPR/Cas9系統在水稻中的應用

CRISPR/Cas9系統具有精度性高、系統構建簡便和多靶位點切割等優勢，常用于小鼠[7]、斑馬魚[8]、果蠅[9]等模式動物。隨著CRISPR/Cas9技術的日趨成熟，該系統在植物方面的應用也相繼出現，為提高模式植物研究的效率，逐漸將CRISPR/Cas9系統應用到水稻的理論研究和育種研究。

Miao等[28]在CAO1基因的第二個外顯子里設計打靶位點，將CRISPR/Cas9系統轉入水稻，產生的突變體因缺少葉綠素b的合成，表現為早期葉片呈淡綠色。Feng等[29]轉化水稻原生質體突變YSA基因，發現10%的轉基因植株在苗期表現葉片白化。在水稻相關的報道中，經打靶產生的植株突變率不高，Xie 等[30]推測CRISPR-Cas系統能對植物產生突變的概率在3%～8%。Shan等[31]用CRISPR/Cas9系統轉化水稻愈傷，發現OsPDS-SP1和OsBADH2基因的突變率分別為9.4%和7.1%，轉化原生質體，發現小麥基因TaMLO和3個水稻基因OsBADH2、Os02g23823、OsMPK2的突變率在26.5%～38%。Shan等[31]利用CRISPR/Cas9系統定點突變水稻OsPDS基因，產生的突變效率在10%以下，但在當代獲得了純合突變體，與野生型相比，純合突變體表現出植株變矮和葉片轉為白化的特點，與預期的表型一致。Zhang等[26]用CRISPR/Cas9系統突變不同功能的10個水稻基因，分別是OsMYB1、OsYSA、OsROC5、OsDERF1、OsPDS、OsMSH1、OsMYB5、OsSPP、OsPMS3和OsEPSPS，獲得的突變率分別為66.7%、66.7%、65.1%、50.9%、41.9%、37%、31.9%、28.9%、26.3%、21.1%和44.4%，平均突變率達44.4%，其中，OsEPSPS基因是合成芳香族氨基酸過程中的一個關鍵酶，OsEPSPS的突變體因不能合成芳香族氨基酸，無法正常生長發育，最終死亡。Zhou等[27]用CRISPR/Cas9系統打靶了水稻中4個控制糖運輸的基因，在T0代獲得的突變率最高達87%，且突變植株大多為雙等位基因類型。Feng等[10]研究發現，因CRISPR/Cas9系統的剪切，產生的突變率在T0代有71.2%，T2代有58.3%，T2代有79.4%。T1代中，突變純合子的純合率為22%，雜合子和嵌合體的突變率為58.3%。其中，將T1代所有突變植株的基因型與T0代突變植株基因型相比，與T0代相一致的突變植株僅占T1代總突變的50%[10]。

研究發現，CRSPR/Cas9系統能夠對水稻基因組進行編輯，且編輯的序列無選擇性，大大提高了研究基因功能的效率，使快速、準確編輯基因序列獲得優良性狀的植株成為可能。然而CRSPR/Cas9系統在水稻中打靶效率較低，因此，通過改良載體體系、轉化體系等提高打靶效率成為亟待解決的一個重要的問題，有待進一步摸索。

7　展望

隨著不同物種基因組測序的完成，探明基因組的功能顯得尤為重要。基因組定點編輯技術是進行基因組定向改造與基因功能研究的一個新興而重要的研究手段。

CRISPR/Cas9系統能夠靶向性地編輯基因組，系統構建簡便、精度高、周期短、成本低。相較于ZFn和TALENs人工核酸酶技術，CRISPR/Cas9系統更具優勢，能夠更加高效地獲得遺傳穩定的突變體，為基因功能研究提供技術和材料保障。同時，可利用CRISPR/Cas9技術在基因組水平上插入或敲除基因，篩選獲得更多環境適應性強、性狀更加優良的育種材料。然而CRISPR/Cas9系統目前尚處于運用和探索階段，存在目標序列PAM鄰近基序缺失、靶向序列切割特異性、不同物種打靶效率差異等問題，成為未來需要解決的一些關鍵問題。但其在高效便捷的基因操作中已表現出巨大優勢，在水稻功能基因組研究中表現出巨大潛力，在創制優質高產的水稻品種中表現出廣闊的應用前景，必將產生深遠影響。

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Research Progress of CRISPR/Cas9 System and Its Application on Rice

PENG Ya-qiong1, CHEN Guang-hui2, LI Yi-xing3, LI Li3*

(1. Hengyang Agricultural Science Research Institute, Hengyang, Hunan 421101; 2 College of Agronomy, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128; 3. Hybrid Rice Research Center of Hunan Province, Changsha, Hunan 410125)

The structure of CRISPR/Cas9 system, the principle of fixed-point mutation, the type of building vectors and the heritability of mutation were reviewed. The factors that influence efficiency of mutations were emphatically analyzed, the current existing research on rice was introduced, and its application in the future was forecasted.

CRISPR/Cas9; Genome editing; Gene targeting; Rice

彭亞瓊(1990- )，女，湖南衡山人，碩士研究生，研究方向：轉基因水稻。*通訊作者，副研究員，博士，碩士生導師，從事水稻分子育種研究。

2016-06-06

S 188

A

0517-6611(2016)22-128-04