動物細胞在Production罐和衛星罐中的培養過程

孫明月，高敏杰，李由然，2（.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 2422；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 2422）

動物細胞在Production罐和衛星罐中的培養過程

孫明月1，高敏杰1，李由然1，2
（1.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122）

動物細胞培養對工藝參數的控制有很高的要求，尤其是培養液的溶氧水平對細胞的生長有著極大的影響。本文主要研究了衛星罐溶氧校準方法的建立以及動物細胞培養過程。首先建立了衛星罐在空氣中校準溶氧100%的方法。其次，在生產中的production反應器與衛星罐中分別對CHO和NS0細胞進行同步培養。結果表明，細胞在production反應器內與衛星罐內的生長代謝情況基本一致，兩種細胞的細胞活率在培養初期都比較穩定，后期呈現逐漸下降的趨勢，活細胞密度呈現先增長后下降的趨勢；而乳酸、葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺濃度也隨著細胞培養時間的變化而呈現出不同的變化趨勢。

細胞培養；Production罐；衛星罐

動物細胞培養是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖過程。在此過程中，細胞不再形成組織。由于動物細胞培養在體外人工條件下進行，方便觀察及調控，從而為當今研究動物的物質代謝過程、遺傳物質的表達調控等提供了有效的新方法。同時，伴隨著分子生物學、分子遺傳學、生物化學以及現代醫藥學等學科的發展，細胞培養在越來越多的領域得到了應用，表現出了其巨大的發展潛力。由于動物細胞沒有細胞壁，它對剪切力十分敏感，從而導致了細胞很難很好地適應體外環境。并且，在體外人工條件下進行培養的細胞，它們沒有神經體液的調節和細胞間相互影響的作用，不僅導致它們失去了原有的組織結構，也很難維持原有的細胞形態。因此，在體外人工條件下進行動物細胞培養的過程中，應十分密切地關注細胞的生長代謝狀態。

1　材料與方法

1.1細胞

CHO：中國倉鼠卵巢細胞。

NS0：小鼠骨髓瘤細胞。

1.2主要儀器及設備

本論文用到的主要儀器及設備如表1所示。

表1　主要儀器及設備

1.3衛星罐設置

主要步驟：組裝反應器→pH電極準備→DO電極準備→DO零點校準→反應器滅菌→DO校準100%。

1.4Production反應器設置

使用buffer（模擬培養基：高純水中含有1.6 g/L NaHCO3，1 g/L PF68）代替培養基，分析DO電極在常溫空氣中與37 ℃飽和溶氧培養基中校準100%的差異。接著將Finesse-6和Applikon-1灌注buffer后設置培養基溫度為37 ℃，過夜通氣（0.2 vvm）直至溶氧穩定（18～24 h）。最后設置DO電極：Mettler-1（連接Finesse-5控制器），Mettler-2（連接Finesse-6控制器），Applikon（連接Applikon-1控制器），檢查完整性、靈敏性良好。三支DO電極分別連通電極線極化18～24 h。

1.5細胞培養

細胞培養包括細胞復蘇，細胞傳代及細胞大規模培養三個步驟，參照文獻進行。

1.6樣品分析

將培養獲得的細胞懸液通過全自動生化分析儀、細胞計數儀對樣品進行分析。

1.6.1全自動生化分析儀

提起取樣器至手動進樣位置，輸入樣品相關信息，按“ANALYZE”鍵進入檢測狀態，取樣探針伸出，屏幕提示呈遞樣品時，將上述樣品獲取中已獲得細胞液的EP管置于取樣探針下，按“ANALYZE”鍵自動吸取樣品，完成后取樣探針自動收回，等待檢測結果。

1.6.2細胞計數儀

用移液槍吸取上述樣品獲取中已獲得細胞液的離心管內少許樣品，分裝到兩個計數杯中（如需要則使用DPBS進行適當稀釋），將計數杯置于細胞計數儀可用的樣品架位置，輸入樣品相關信息，開始計數，等待計數結果。

2　結果與討論

2.1Production反應器與衛星罐內細胞的生長情況

Production反應器采用傳統方式，在飽和溶氧的培養基中校準DO100%，衛星罐則在空氣中進行DO100%校準，對CHO和NS0分別在兩種反應器內進行同步培養。通過觀察production反應器內與衛星罐內細胞活率、活細胞密度的變化以及乳酸、葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺濃度變化分析細胞的生長代謝情況。

通過細胞計數儀檢測細胞活率和活細胞密度分析production反應器內與衛星罐內細胞生長情況，檢測結果如圖1、圖2、圖3和圖4所示：

圖1　CHO細胞活率變化曲線圖

圖2　NS0細胞活率變化曲線圖

圖3　CHO活細胞密度變化曲線圖

圖1、圖2、圖3和圖4為CHO和NS0分別在2 000 L production反應器以及15 L和3 L衛星罐中培養數天后的細胞活率變化曲線圖及活細胞密度變化曲線圖。2 000 L Run1為反應器生產第一批，2 000 L Run2為反應器生產第二批；Satellite1為衛星罐培養第一批，Satellite2為衛星罐培養第二批。由圖1、圖2可見，對于同一種細胞類型，production反應器與衛星罐內細胞活率變化曲線基本一致，細胞活率在培養初期比較穩定，CHO細胞活率從第8天開始出現下降趨勢，NS0細胞活率從第7天開始出現下降趨勢。由圖3、圖4可見，對于同一種細胞類型，兩反應器內活細胞密度變化曲線基本一致，曲線呈現先增長后下降的趨勢，CHO細胞密度在第8天達到峰值，NS0細胞密度在第7天達到峰值。

2.2Production反應器與衛星罐內細胞的代謝情況

通過全自動生化分析儀檢測細胞代謝中乳酸、葡萄糖、谷氨酸和谷氨酰胺濃度變化分析production反應器內與衛星罐內細胞代謝情況，檢測結果如圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12所示：

2.2.1葡萄糖的代謝

葡萄糖的主要代謝途徑有3個：一是進入TCA循環，二是進入磷酸戊糖途徑，三是經過糖酵解途徑生成多糖和乳酸。其中只有極少部分葡萄糖進入TCA循環和磷酸戊糖途徑，大部分的葡萄糖都是通過糖酵解途徑直接轉化為乳酸［1］。由圖5、圖6、圖7和圖8可見，對于同一種細胞類型，production反應器與衛星罐內乳酸濃度和葡萄糖濃度變化曲線基本一致。培養初期，細胞消耗葡萄糖產生副產物乳酸，葡萄糖含量不斷下降，乳酸相應不斷積累，當葡萄糖消耗至不能滿足細胞生長時，細胞開始消耗乳酸，因此乳酸含量開始下降。此時通過補充營養，使葡萄糖含量維持在穩定水平，乳酸含量也基本穩定。此外，由于CHO和NS0細胞類型的不同以及兩種細胞培養工藝的不同，兩種細胞在培養過程中，乳酸積累達到的最高濃度相應不同，葡萄糖及乳酸濃度穩定的水平也相應的不同。

圖4　NS0活細胞密度變化曲線圖

圖5　CHO培養過程中乳酸濃度變化曲線圖

圖6　NS0培養過程中乳酸濃度變化曲線圖

圖7　CHO培養過程中葡萄糖濃度變化曲線圖

圖8　NS0培養過程中葡萄糖濃度變化曲線圖

圖9　CHO培養過程中谷氨酸濃度變化曲線圖

圖10　NS0培養過程中谷氨酸濃度變化曲線圖

圖11　CHO培養過程中谷氨酰胺濃度變化曲線圖

圖12　NS0培養過程中谷氨酰胺濃度變化曲線圖

2.2.2谷氨酰胺的代謝

谷氨酰胺的碳骨架有三條代謝途徑，即進入TCA循環以及通過轉氨途徑生成非必需氨基酸，還有部分直接合成胞內蛋白和抗體。在細胞中，谷氨酰胺主要通過谷氨酰胺酶脫氨生成氨和谷氨酸進入代謝途徑。谷氨酸可經谷氨酸脫氫酶催化脫氫生成α-酮戊二酸和氨，還可由轉氨酶催化途徑生成α-酮戊二酸和非必需氨基酸如丙氨酸、天冬氨酸等，生成的α-酮戊二酸進入TCA循環［1］。由圖9、圖10、圖11和圖12可見，對于同一種細胞類型，production反應器與衛星罐內谷氨酸和谷氨酰胺濃度變化曲線基本一致。培養初期，細胞消耗谷氨酰胺較多，谷氨酰胺濃度呈下降趨勢，同時生成副產物谷氨酸，谷氨酸逐漸積累，后期谷氨酰胺濃度逐漸趨于平穩，谷氨酰胺含量則呈現逐漸上升的趨勢。同時，由于CHO和NS0細胞類型的不同以及兩種細胞培養工藝的不同，兩種細胞在培養過程中，谷氨酸在逐漸積累的過程中達到的濃度相應不同，谷氨酰胺濃度穩定的水平也相應的不同。

［1］高紅亮，叢威，歐陽藩.雜交瘤細胞的代謝流量分析［J］.生物工程學報，2000，（6）.

（編輯：張淑鳳）

Q814

A

1006-799X（2016）12-0089-04

孫明月（1994-），女，江蘇泰州人，本科在讀，主要從事生物技術的研究工作。