1，25-（OH）2D3對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠Erbin表達(dá)的影響

張國(guó)銳，林智峰，楊曉萍△，趙　瑾，陶　林（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：.第一附屬醫(yī)院腎病科，.病理教研室，新疆石河子83008）

1，25-（OH）2D3對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠Erbin表達(dá)的影響

張國(guó)銳1，林智峰1，楊曉萍1△，趙瑾2，陶林2（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院：1.第一附屬醫(yī)院腎病科，2.病理教研室，新疆石河子832008）

目的探討活性維生素D3——1，25-二羥維生素D3［1，25-（OH）2D3］對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）大鼠Erbin表達(dá)的影響。方法將96只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、干預(yù)組、假手術(shù)組和UUO模型組，每組24只。干預(yù)組和UUO模型組大鼠在左腎下極處游離并結(jié)扎左輸尿管建立UUO模型，假手術(shù)組開(kāi)腹后僅游離左輸尿管，干預(yù)組在建模起給予活性維生素D30.5 μg、花生油1 mL灌胃，每天1次，共計(jì)14 d，于術(shù)后1、3、7、14 d分別處死各組大鼠6只，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠Erbin、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的表達(dá)。結(jié)果UUO模型組大鼠Erbin、TGF-β1表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組、假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；干預(yù)組大鼠Erbin表達(dá)明顯高于模型組，TGF-β1表達(dá)明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論1，25-（OH）2D3可能增加UUO大鼠腎組織Erbin的表達(dá)，抑制TGF-β1的表達(dá)，減輕腎臟纖維化。

維生素D；腎小球硬化癥，局灶節(jié)段性；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；Erbin

維生素D3的激素（活性）形式為1，25-二羥維生素D3［1-alpha，25-dihydroxy-cholecalcifero；1，25-（OH）2D3］，活性維生素D3能維持鈣和磷的平衡，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫，保護(hù)臟器功能［1］；可減少足細(xì)胞損傷，恢復(fù)腎小球Nephrin的表達(dá)，減少尿蛋白，保護(hù)腎功能［2］。當(dāng)腎臟受損時(shí)1-α羥化酶作用減弱，體內(nèi)1，25-（OH）2D3減少，那么，其減少是否參與了腎臟病的發(fā)生、發(fā)展呢？絕大多數(shù)的慢性腎臟病最終發(fā)展為尿毒癥期均會(huì)出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化；近年來(lái)，有研究表明，1，25-（OH）2D3能延緩或改善腎間質(zhì)纖維化，但其機(jī)制尚不清楚［3］。因此，本研究旨在探討活性維生素D3對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料1，25-（OH）2D3粉劑由海爾制藥公司提供。花生油為溶劑，配成0.5 μg/mL。兔抗大鼠Erbin抗體由Abcam公司提供。兔抗鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）多克隆抗體由北京博奧森公司提供。4周齡清潔級(jí)健康雄性SD大鼠96只購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量（200±20）g，在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，室溫，自然飲水、進(jìn)食。

1.2方法

1.2.1分組將96只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、干預(yù)組、假手術(shù)組和UUO模型組，每組24只。干預(yù)組和UUO模型組大鼠在左腎下極處游離并結(jié)扎左輸尿管建立UUO模型，假手術(shù)組開(kāi)腹后僅游離左輸尿管，干預(yù)組在建模起給予活性維生素D30.5 μg、花生油1 mL灌胃，每天1次；正常對(duì)照組、模型組及假手術(shù)組均給予每天1mL花生油灌胃共計(jì)14 d。

1.2.2取材術(shù)后第1、3、7、14 d分別處死各組大鼠6只，取左腎標(biāo)本進(jìn)行病理檢查及免疫組織化學(xué)（免疫組化）染色。

1.2.3免疫組化染色結(jié)果判定采用SP法檢測(cè)腎組織中Erbin、TGF-β1的表達(dá)，由本校病理教研室3名專(zhuān)家單獨(dú)觀察結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果判定：高倍鏡下（400×）選5個(gè)腎小管間質(zhì)視野（避開(kāi)腎小球和大血管）觀察染色細(xì)胞面積和強(qiáng)度，計(jì)算平均值作為最后結(jié)果。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析F檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠腎組織形態(tài)學(xué)變化比較與對(duì)照組、假手術(shù)組比較，UUO模型組大鼠左腎腫大，腎皮質(zhì)變薄，腎盂中有尿液積聚；與UUO模型組比較，干預(yù)組大鼠左腎較小，腎盂積尿減少，腎皮質(zhì)稍厚。

2.2各組大鼠Erbin表達(dá)比較Erbin主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)中。UUO模型組大鼠Erbin表達(dá)均明顯高于正常對(duì)照組、假手術(shù)組，干預(yù)組大鼠Erbin表達(dá)明顯高于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、圖1。

表1　各組大鼠Erbin表達(dá)比較（±s）

表1　各組大鼠Erbin表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組、假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.05；UUO與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05。

時(shí)間術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d n　6 6 6 6正常對(duì)照組　假手術(shù)組　UUO模型組　干預(yù)組0.12±0.15 0.13±0.18 0.11±0.14 0.12±0.20 0.14±0.10 0.15±0.14 0.13±0.14 0.14±0.18 1.47±0.32 3.83±0.16a4.56±0.16a5.26±0.16a1.52±0.20 4.21±0.17b5.30±0.36b6.60±0.41b

圖1　UUO模型組與干預(yù)組大鼠Erbin表達(dá)比較

2.3各組大鼠TGF-β1表達(dá)比較TGF-β1主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞質(zhì)中。UUO模型組大鼠TGF-β1表達(dá)均明顯著高于正常對(duì)照組、假手術(shù)組，干預(yù)組大鼠TGF-β1表達(dá)明顯低于UUO模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表2。

表2　各組大鼠TGF-β1表達(dá)比較（±s）

表2　各組大鼠TGF-β1表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組、假手術(shù)組同時(shí)間點(diǎn)比較，aP＜0.01；UUO與模型組同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.01。

時(shí)間術(shù)后1 d術(shù)后3 d術(shù)后7 d術(shù)后14 d n　6 6 6 6正常對(duì)照組　假手術(shù)組　UUO模型組　干預(yù)組0.13±0.16 0.13±0.16 0.13±0.16 0.13±0.16 0.23±0.23 0.30±0.35 0.86±0.24 1.20±0.36 0.31±0.19a1.90±0.48a2.51±0.50a3.70±0.27a0.16±0.17b1.00±0.20b1.28±0.41b2.60±0.47b

2.4Erbin表達(dá)與TGF-β1表達(dá)的相關(guān)性TGF-β1、Erbin表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)、腎間質(zhì)病理?yè)p害程度加重而增加，Erbin表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.871，P＜0.01）。

3　討　論

腎間質(zhì)纖維化具體機(jī)制目前尚不清楚，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚和間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞增生。目前，已有研究證實(shí)，腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞大部分是由腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）而來(lái)［4］。目前發(fā)現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化與TGF-β1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、腎組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)、蛋白尿、核因子-κB等有關(guān)［5］，而EMT在腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中可能具有關(guān)鍵性作用。

Erbin是富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeat，LRR）及（PDZ-containing protein，PDZ）結(jié)構(gòu)域蛋白的LAP家族的新成員，Erbin包含16個(gè)LRR及1個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域，Erbin主要分布于大腦、心臟、肌肉、腎臟等組織中，參與上皮細(xì)胞的黏附過(guò)程，Erbin在細(xì)胞極性形成與維持細(xì)胞黏附中具有重要作用［6］。上皮細(xì)胞黏附及細(xì)胞極性的破壞是EMT的重要環(huán)節(jié)［4］；有研究證明，Erbin在腎臟纖維化中具有保護(hù)作用［7］，但其具體機(jī)制尚不明確。

本研究采用大鼠UUO模型，觀察腎間質(zhì)病變及Erbin表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，UUO模型組于術(shù)后3 d既出現(xiàn)Erbin表達(dá)增高（圖1），并持續(xù)高表達(dá)；TGF-β1、Erbin表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)、腎間質(zhì)病理?yè)p害程度加重而增加，Erbin表達(dá)與TGF-β1表達(dá)呈正相關(guān)（r＝0.871，P＜0.01）。與程紅新等［8］研究結(jié)果一致，分析其原因可能是UUO模型建立后隨著炎性反應(yīng)加強(qiáng)，炎癥介質(zhì)的釋放，TGF-β1表達(dá)開(kāi)始增加，TGF-β1可能通過(guò)活化smad2/3信號(hào)通路促進(jìn)EMT的發(fā)生［9］，從而加重病理?yè)p害，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生；近年來(lái)，有研究已證實(shí)，腎切除5/6建立的腎纖維化模型的腎組織中 Erbin表達(dá)明顯增高，在TGF-β1刺激的NRK52E細(xì)胞中Erbin mRNA及蛋白水平均增高［10］，本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)；有研究表明，Erbin可結(jié)合Smard3和Smard2，阻止Smards復(fù)合物入核，進(jìn)而拮抗TGF-β1的致纖維化作用［11］。提示高表達(dá)Erbin在腎纖維化中具有保護(hù)作用，本研究用1，25-（OH）2D3干預(yù)UUO后TGF-β1表達(dá)低于UUO模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而Erbin在術(shù)后1 d無(wú)明顯變化，術(shù)后3、14 d大鼠腎組織Erbin表達(dá)增加（圖1），干預(yù)組大鼠腎組織腎小管上皮細(xì)胞中Erbin染色面積及強(qiáng)度均增加，提示活性維生素D3可能從蛋白水平使Erbin高表達(dá)，進(jìn)而降低TGF-β1表達(dá)，從而抑制了EMT，延緩了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。

總之，本研究結(jié)果表明，活性維生素D3可通過(guò)使Erbin高表達(dá)，抑制TGF-β1表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了活性維生素D3對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制，為慢性腎間質(zhì)纖維的治療提供了新的方向。

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Effect of 1，25-（OH）2D3on Erbin expression in unilateral ureteral obstruction rat model

Zhang Guoruil，Lin Zhifengl，Yang Xiaopingl△，Zhao Jin2，Tao Lin2（l.Department of Nephrology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital；2.Department of Pathology，Medical College of Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832008，China）

ObjectiveTo investigate the effect of activated vitamin D3-1，25-（OH）2D3on the Erbin expression in uni lateral ureteral obstruction（UUO）rat.MethodsNinety-six SD rats were randomly divided into the normal control group，intervention group，sham operation group and UUO model group according to the random number table method，24 cases in each group. The UUO model in the intervention group and the UUO model group was established by freeing and ligating the left ureter at the inferior polar of the left kidney，the left ureter in the sham operation group was only dissociated after lapatotomy，while the intervention group was given activated vitamin D3 0.5μg and peanut oil1 mL by gavage from the beginning of model construction，once daily，for 14 d.Six rates in each group were killed on postoperative 1，3，7，14 d.The immunohistochemical method was used to detect the expression of TGF-β1 and Erbin in each group.ResultsThe expressions of Erbin and TGF-β1 in the UUO model group were significantly higher than those in the normal control group and sham operation group，the differences were statistically significant（P＜0.05）；the expression of Erbin in the intervention group was significantly higher than that in the model group，while the TGF-β1 expression was significantly lower than that in the model group，the difference was statistically significant（P＜0.01）. Conclusion1，25-（OH）2D3may increase the Erbin expression in renal tissue of UUO rat，inhibits the TGF-β1 expression and alleviates renal interstitial fibrosis.

Vitamin D；Glomerulosclerosis，focal segmental；Transforming growth factor beta1；Erbin

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.010

A

1009-5519（2016）17-2650-02

張國(guó)銳（1985-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事腎小球疾病發(fā)病機(jī)制的研究。△

，E-mail：sbkyxp@163.com。

2016-04-27）