銀杏葉提取物對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞能量代謝障礙與凋亡的影響*

陳　琦，詹亞梅，謝　娟（貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550002）

銀杏葉提取物對(duì)去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞能量代謝障礙與凋亡的影響*

陳琦，詹亞梅，謝娟△（貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽550002）

目的研究銀杏葉提取物（GBE）對(duì)去甲腎上腺素（NE）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞能量代謝障礙及凋亡的保護(hù)作用。方法用1.00 μmol/L NE損傷小鼠心肌細(xì)胞（NE模型對(duì)照組），用不同濃度GBE（終濃度分別為1.00、0.10、0.01 μmol/L）進(jìn)行干預(yù)，在電子顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)心肌細(xì)胞乳酸脫氫酶（LDH）、線粒體琥珀酸脫氫酶（MSDH）及腺苷三磷酸酶（ATPase）活性。結(jié)果NE模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平升高，MSDH及ATPase活力降低。1.00、0.10 μmol/L GBE能明顯升高心肌細(xì)胞存活率，降低培養(yǎng)上清液中LDH水平，提高M(jìn)SDH及ATPase活性，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有明顯保護(hù)作用。結(jié)論GBE能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)，降低LDH水平，增加ATPase及MSDH活性，對(duì)NE所致的心肌細(xì)胞能量代謝障礙和凋亡具有明顯保護(hù)作用。

銀杏；植物提取物；去甲腎上腺素；肌細(xì)胞，心臟；能量代謝；細(xì)胞凋亡

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床綜合征，是各種心臟病的嚴(yán)重階段，其中交感神經(jīng)活性增加使心肌交感神經(jīng)末梢分泌去甲腎上腺素（nonepinephrine，NE）增加，是導(dǎo)致心力衰竭的重要因素［1］。且現(xiàn)有研究證實(shí)，心肌細(xì)胞凋亡在慢性充血性心力衰竭中具有重要作用［2］。銀杏作為一種古老的植物，其藥用價(jià)值高，多年來被廣泛應(yīng)用。銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）是從銀杏葉中分離純化的化合物，近年來，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用GBE治療神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病，有關(guān)藥理學(xué)基礎(chǔ)研究也不斷獲得新的認(rèn)識(shí)［3-5］。

已有研究表明，GBE具有廣泛的藥理作用，在心血管疾病的治療方面可增加人血漿抗氧化能力，減少血栓形成，降低血清膽固醇，擴(kuò)張血管，增加血流量，改善缺血組織代謝，在心肌缺血再灌注中清除氧自由基［6］。GBE中所含的黃酮化合物具有明顯的抗氧化和抗自由基活性，其分子中含有還原性羥基功能基團(tuán)，可直接發(fā)揮抗氧化作用。NE對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞的損傷作用與自由基產(chǎn)生較多導(dǎo)致氧化損傷有關(guān)，而GBE可通過增強(qiáng)還原性對(duì)抗其損傷作用，但其具體作用途徑及作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步研究［7-9］。GBE對(duì)鈣離子（Ca2+）通道具有抑制作用，GBE可能是通過抑制慢鈣通道縮短有效不應(yīng)期而發(fā)揮其抗心律失常的作用。為此，觀察GBE注射液對(duì)NE誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞能量代謝及凋亡的影響，可為臨床應(yīng)用GBE的新的適應(yīng)證的研究提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑小鼠心肌細(xì)胞株MCM（上海志研生物有限公司）、GBE（臺(tái)灣濟(jì)生化學(xué)制藥股份有限公司）、葛根素注射液（濟(jì)南利民制藥有限責(zé)任公司）、重酒石酸NE注射液［遠(yuǎn)大醫(yī)藥（中國(guó)）有限公司］、高糖杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco′smodified Eagle medium，DMEM，Hyclone公司）、胎牛血清（GIBOC公司）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS，Solarbio公司）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）、青霉素-鏈霉素雙抗（Hyclone公司）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Solarbio公司）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）、ATPase測(cè)試盒（高速，南京建成生物工程研究所）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehy drogenase，MSDH）試劑盒（南京建成生物工程研究所）等。

1.1.2主要儀器721型可見光分光光度計(jì)，Thermo二氧化碳培養(yǎng)箱，EI-808IU型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Eppendorf 5417R冷凍離心機(jī)，XD-101型電生理倒置顯微鏡，6、24、96孔培養(yǎng)板等。

1.2方法

1.2.1心肌細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)第3代小鼠心肌細(xì)胞，培養(yǎng)基為高糖DMEM，10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗，靜置于37℃、5%二氧化碳、飽和濕度條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待心肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化，離心后棄上清液，重懸心肌細(xì)胞，進(jìn)行傳代，取增殖旺盛、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的心肌細(xì)胞用于研究。

1.2.2分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞進(jìn)行研究，棄培養(yǎng)液，用PBS洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化，離心去除消化液，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸心肌細(xì)胞，調(diào)整心肌細(xì)胞為每毫升（1～2）×104個(gè)。將心肌細(xì)胞懸液按每孔100 μL接種于無菌96孔板中，待心肌細(xì)胞貼壁后（同步4 h后）去除培養(yǎng)液，用37℃預(yù)熱PBS洗滌1次，加入用培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的藥物，分為正常對(duì)照組，NE模型對(duì)照組，GBE高、中、低濃度組（終濃度分別為1.00、0.10、0.01 μmol/L），葛根素組（1 mg/mL）。各組加入藥物溫孵0.5 h后除正常對(duì)照組外，其余各組均加入NE使其終濃度為1.00 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后觀察各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.3觀察指標(biāo)

1.2.3.1觀察心肌細(xì)胞形態(tài)在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3.2檢測(cè)心肌細(xì)胞MSDH活性（心肌細(xì)胞存活率）心肌細(xì)胞經(jīng)NE誘導(dǎo)及給藥后每孔加入噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)后每孔加入DMSO150μL，低速振蕩5min，然后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A570）。

1.2.3.3檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平心肌細(xì)胞經(jīng)NE誘導(dǎo)及給藥后收集上清液，參照試劑盒說明書測(cè)定培養(yǎng)上清液中LDH水平。

1.2.3.4檢測(cè)心肌細(xì)胞腺苷三磷酸酶（adenosine three phosphatase，ATPase）活性心肌細(xì)胞經(jīng)NE誘導(dǎo)及給藥后收集上清液并加入0.1%聚乙二醇辛基苯基醚裂解心肌細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明測(cè)定鈉離子-鉀離子-ATPase（Na+-K+-ATPase）和Ca2+-ATPase活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以±s表示，方差齊性檢驗(yàn)后，若方差齊兩兩比較采用t檢驗(yàn)，若方差不齊采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)比較正常對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)16 h后在顯微鏡下可觀察到心肌細(xì)胞已大部分貼壁生長(zhǎng)，貼壁生長(zhǎng)后的心肌細(xì)胞多呈梭形或不規(guī)則星形，胞體清亮，細(xì)胞質(zhì)成分豐富，向外伸出多個(gè)長(zhǎng)短不同的突起。隨著心肌細(xì)胞不斷長(zhǎng)大，心肌細(xì)胞伸出偽足相互交織成網(wǎng)。NE模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，葛根素組、GBE高、中濃度組大鼠心肌細(xì)胞損傷強(qiáng)度明顯低于NE模型對(duì)照組，見圖1。

圖1　各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)比較（400×）

2.2GBE對(duì)MSDH及ATPase活性、LDH水平的影響

NE模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞MSDH及ATPase活性降低，培養(yǎng)上清液中LDH水平增加；GBE高、中濃度組大鼠心肌細(xì)胞ATPase及MSDH活性明顯高于NE模型對(duì)照組，培養(yǎng)上清液中LDH水平明顯低于NE模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、2。

表1　GBE對(duì)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞能量代謝障礙及凋亡模型心肌細(xì)胞存活率的影響

表2　GBE對(duì)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞能量代謝障礙及凋亡模型心肌細(xì)胞LDH水平及ATPase活性的影響（±s）

表2　GBE對(duì)NE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞能量代謝障礙及凋亡模型心肌細(xì)胞LDH水平及ATPase活性的影響（±s）

注：與NE模型對(duì)照組比較，aP＜0.05。

組別n LDH A570　U/L ATPase［μmol/（mgprot·h）］Na+-K+-ATPase　Ca2+-ATPase GBE高濃度組GBE中濃度組GBE低濃度組葛根素組正常對(duì)照組NE模型對(duì)照組5.110±2.320a4.160±1.040a2.670±0.670 4.010±2.090a5.060±1.320 2.330±0.500 6 6 6 6 6 6 0.381±0.012 0.370±0.026 0.518±0.008 0.387±0.002 0.401±0.006 0.575±0.060 416.100±8.010a403.400±8.050a543.700±12.640 422.900±19.540a439.100±14.940 639.100±47.120 5.260±1.510a4.140±2.240a2.570±1.260 5.740±2.880a5.140±1.940 2.300±1.490

3　討　論

兒茶酚胺（以NE為代表）的大量釋放引起的心肌肥大與其過度激動(dòng)心臟腎上腺素能受體造成的心肌相對(duì)缺血、缺氧及兒茶酚胺引起的脂質(zhì)過氧化、氧自由基的產(chǎn)生、能量代謝障礙和鈣超載等相關(guān)。且近年來有研究表明，NE誘導(dǎo)的心肌肥大與心肌凋亡通路密切相關(guān)［10］。

GBE的主要成分為銀杏黃酮苷和銀杏總內(nèi)酯。過去幾十年，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)GBE的作用機(jī)制進(jìn)行了大量研究，基礎(chǔ)及臨床研究均證實(shí)，GBE具有廣泛的藥理作用：銀杏黃酮苷主要作用為清除自由基與抗氧化作用，阻止低密度脂蛋白被氧化；而銀杏內(nèi)酯類的主要作用為拮抗血小板活化因子，改善血流動(dòng)力學(xué)與血液流變學(xué)，并能抑制自由基的產(chǎn)生，二者具有交叉、協(xié)同作用。

LDH、MSDH、ATPase是反映心肌能量代謝的重要指標(biāo)。線粒體中的MSDH能代謝還原MTT，同時(shí)，在細(xì)胞色素C的作用下生成藍(lán)色（或藍(lán)紫色）不溶于水的甲臜，經(jīng)異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下，甲臜生成量與活細(xì)胞數(shù)呈正比，因此，可根據(jù)A570推測(cè)活細(xì)胞數(shù)目。心肌細(xì)胞膜損傷時(shí)導(dǎo)致LDH外漏，使心肌細(xì)胞外LDH水平增加。ATPase活性是反映多種細(xì)胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標(biāo)。Na+-K+-ATPase對(duì)維持細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度平衡具有重要作用。Na+-Ca2+交換跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，Ca2+能量是由胞內(nèi)Na+電化學(xué)梯度作為轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+的能源。Ca2+-ATPase在Ca2+和鎂離子存在情況下亦可將Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體、肌漿網(wǎng)或細(xì)胞外。NE作用于心肌細(xì)胞使Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性降低，致使Ca2+大量進(jìn)人心肌細(xì)胞內(nèi)，形成Ca2+超載。Ca2+是一種強(qiáng)解耦聯(lián)劑，與電子傳遞系統(tǒng)親和力較強(qiáng)，使線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián)，從而使心肌細(xì)胞內(nèi)能量代謝產(chǎn)生障礙。

本研究通過體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞，采用NE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞能量代謝障礙及凋亡，并加入高、中、低3種濃度GBE，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、LDH水平、MSDH及ATPase活性等探討GBE對(duì)心肌細(xì)胞能量代謝及凋亡的影響。結(jié)果表明，NE模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞存活率降低，GBE高、中濃度組大鼠心肌細(xì)胞存活率升高，表明GBE對(duì)心肌細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。NE模型對(duì)照組大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平高于正常對(duì)照組，提示NE損傷了心肌細(xì)胞膜，GBE高、中濃度組大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH水平明顯低于NE模型對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。同時(shí)，GBE可改善NE作用后ATPase活性的降低，增強(qiáng)離子泵主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)離子的功能，以保持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度差，增加勢(shì)能貯備，為細(xì)胞的其他耗能過程提供能量。高、中濃度GBE既能有效抑制心肌細(xì)胞凋亡，又能降低LDH水平，增加心肌細(xì)胞內(nèi)ATPase活性，與NE模型對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。證實(shí)GBE可明顯抑制高交感活性誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，還能干預(yù)心肌的能量代謝，對(duì)心肌細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，間接地為臨床選擇GBE治療心血管類相關(guān)疾病提供了理論依據(jù)。

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Effects of ginkgo biloba extract on energy metabolism disorder and apoptosis in noradrenaline induced cardiomyocytes*

ChenQi，ZhanYamei，XieJuan△（DepartmentofPharmacy，GuizhouProvincialPeople′sHospital，Guiyang，Guizhou550002，China）

ObjectiveTo study the protective effect of ginkgo biloba extract（GBE）on the noradrenaline（NE）induced cardiomyocyte energy metabolism disorder.Methods1.00 μmol/L NE was used to injure the cardiomyocyte（modelcontrolgroup）. Then different concentrations of GBE（final concentration of 1.00，0.10，0.01 μmol/L）were used to conduct the intervention.The cardiomyocyte morphology was observed with electronic microscope.The activity of lactic dehydrogenase（LDH），mitochondrial succinate dehydrogenase（MSDH）and ATPase were determined.ResultsThe LDH level in supernatant of cardiomyocyte culture in the model control group was increased，while the activities of MSDH and ATPase were decreased.1.00，0.10 μmol/L GBE could significantly increase the cardiomyocyte survival rate，decreased the LDH level in supernatant，elevated the MSDH and ATPase activities and had obviously protective effect on cardiomyocyts.ConclusionGBE could effectively inhibit the cardiomyocyte apoptosis，meanwhile reduces the LDH level，increases the ATPase and MSDH activities and has obviously protective effect ton NE induced cardiomyocyte energy metabolism disorder.

Ginkgo biloba；Plant extracts；Levonorepinephrine；Myocytes，cardiac；Energy metabolism；Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.005

A

1009-5519（2016）17-2634-03

貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項(xiàng)（QZYY2012-40）。

陳琦（1982-），碩士研究生，主管藥師，主要從事藥理學(xué)、臨床藥學(xué)研究。

，E-mail：xiejuan945@sohu.com。

2016-05-13）