母嬰分離大鼠腦-腸軸內(nèi)P物質(zhì)及其NK1受體的表達(dá)

滕衛(wèi)軍　丁明星　方遠(yuǎn)書　方馬榮

母嬰分離大鼠腦-腸軸內(nèi)P物質(zhì)及其NK1受體的表達(dá)

滕衛(wèi)軍丁明星方遠(yuǎn)書方馬榮

目的 研究P物質(zhì)及其受體在新生期母嬰分離大鼠模型腦-腸軸上的表達(dá)。方法 將新生期Sprague-Dawley雄性大鼠隨機(jī)分為兩組：母嬰分離組：在出生后第2～21天，使新生大鼠與哺乳期母鼠分離3h/d。對(duì)照組：在出生后第2～21天，不給予任何處理。成年后（出生后60d）給予結(jié)直腸球囊擴(kuò)張（CRD），取遠(yuǎn)端結(jié)腸、腰骶段脊髓和中腦進(jìn)行P物質(zhì)和NK1受體免疫組化檢測(cè)并定量分析。結(jié)果 母嬰分離組大鼠和對(duì)照組比較，結(jié)腸肌層P物質(zhì)陽性面積百分?jǐn)?shù)、結(jié)腸NK1受體陽性肌間神經(jīng)叢數(shù)目、脊髓背角P物質(zhì)陽性面積、脊髓背角NK1陽性分布積分、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）和中縫核（DR）內(nèi)P物質(zhì)陽性面積、中腦PAG和DR內(nèi)NK1陽性分布積分差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。結(jié)論 新生期母嬰分離對(duì) P物質(zhì)和NK1受體表達(dá)的影響不明顯，P物質(zhì)和NK1受體在母嬰分離大鼠模型內(nèi)臟感覺過敏發(fā)生機(jī)制中的作用可能不大。

內(nèi)臟感覺過敏 新生期母嬰分離 P物質(zhì) NK1受體

P物質(zhì)是一種神經(jīng)肽，包含11個(gè)氨基酸，屬于速激肽家族中的一員。NK1受體對(duì)P物質(zhì)有高親和力。P物質(zhì)和NK1受體在腸道和脊髓及腦中發(fā)揮作用，可能參與內(nèi)臟痛覺過敏的外周和中樞機(jī)制［1］。深入開展內(nèi)臟感覺過敏機(jī)制的研究必須建立在腸易激綜合征（IBS）內(nèi)臟感覺過敏的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，而新生期母嬰分離對(duì)大鼠是一種早期生活事件，可致幼鼠包括局部腦血流和可塑性變化等神經(jīng)-內(nèi)分泌的變化及腦-腸軸的改變［2］，具有內(nèi)臟痛覺過敏和應(yīng)激后結(jié)腸運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)等表現(xiàn)，能較好模擬IBS患者的主要特征［3］。考慮到P物質(zhì)和NK1受體在內(nèi)臟痛和痛覺過敏中的作用，本實(shí)驗(yàn)以新生期母嬰分離大鼠模型為研究對(duì)象，檢測(cè)結(jié)腸和脊髓及中腦水平P物質(zhì)和NK1的分布和表達(dá)，報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1動(dòng)物分組 將出生后第1天的新生大鼠Sprague-Dawley雄性大鼠（由金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）隨機(jī)分為兩組：母嬰分離組（16只）和對(duì)照組（16只），每籠8只新生大鼠，然后將哺乳期母鼠隨機(jī)分配給每籠，使每籠包括8只新生大鼠和1只哺乳期母鼠。母嬰分離組：在出生后第2～21天，將新生大鼠與哺乳期母鼠分離3h/d。對(duì)照組：在出生后第2～21天，不給予任何處理。飼養(yǎng)環(huán)境：每周半量換木屑?jí)|料，出生后第22天斷奶，第30天分籠，每籠4只大鼠。晝-夜循環(huán)（6：00開燈，18：00關(guān)燈），自由飲水飲食，室溫（20±1）℃。直到出生后60d（體重280～320g）進(jìn)行其它操作。所有的實(shí)驗(yàn)程序按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物批準(zhǔn)協(xié)議進(jìn)行。

1.2新生期母嬰分離 在出生后第2～21天，每天將新生大鼠與哺乳期母鼠分離3h。具體操作如下：早上9：00開始，將哺乳期母鼠從籠中拎出放入另一個(gè)單獨(dú)的籠中；然后將新生大鼠作為一個(gè)整群（每群8只）從籠中移出，放入另一個(gè)單獨(dú)的籠中（籠內(nèi)鋪有3cm厚的木屑?jí)|料），再將此籠轉(zhuǎn)移至隔壁房間，溫度為室溫（20±1）℃；3h后，將新生大鼠放回最初籠中，使之在墊料上翻滾，然后將哺乳期母鼠放回。

1.3結(jié)直腸球囊擴(kuò)張（CRD） 大鼠成年后（出生后60d）進(jìn)行結(jié)直腸球囊擴(kuò)張：大鼠經(jīng)2%異弗醚（含氧量為0.2L/min）麻醉后，將石蠟油潤(rùn)滑后帶氣囊的8F導(dǎo)尿管經(jīng)肛門插入約6cm，用膠帶紙將導(dǎo)管纏繞固定在大鼠尾根部，導(dǎo)管經(jīng)三通管連接10ml注射器和汞柱式血壓計(jì)，使球囊內(nèi)壓力（代表結(jié)直腸內(nèi)壓力）得以實(shí)時(shí)監(jiān)控。然后將大鼠放在塑料平臺(tái)上（30cm×20cm），使之蘇醒并適應(yīng)環(huán)境30min后，經(jīng)注射器注氣給予結(jié)直腸球囊快速時(shí)相性壓力擴(kuò)張，分別給于10、20、40、60和80mmHg擴(kuò)張壓力。即快速注氣使球囊壓力達(dá)到10mmHg，維持此壓力20s，然后抽出氣體使球囊內(nèi)壓力降至0，4min后重復(fù)上述擴(kuò)張過程，同理依次分別給予20、40、60和80mmHg擴(kuò)張壓力。

1.4免疫組化檢測(cè)P物質(zhì)和NK1受體在結(jié)腸和脊髓及中腦的免疫反應(yīng)分布和表達(dá) 組織獲?。航Y(jié)直腸擴(kuò)張后，成年大鼠經(jīng)腹腔注射7%水合氯醛（35mg/100g體重）麻醉后，經(jīng)左心室灌注0.85%生理鹽水約100ml，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛磷酸緩沖液（0.1mol/L，pH7.4）約300ml。取遠(yuǎn)端結(jié)腸（距肛門5～6cm）、腰骶段脊髓（L6～S1）及中腦后固定于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中，置于4℃冰箱中過夜，然后將組織浸于25%蔗糖磷酸緩沖液中約24～48h，之后將組織冷凍包埋于OCT復(fù)合物。在-20℃恒溫冷凍切片機(jī)中切片，結(jié)腸切片厚15μm，脊髓及中腦切片厚40μm，分別用免疫熒光標(biāo)記方法進(jìn)行漂染。結(jié)腸、脊髓及中腦切片的免疫熒光標(biāo)記方法、步驟如下：漂洗切片于0.01mol/L的PBS緩沖液中2×10min；孵育切片于包含0.3%Triton x-100和10%正常山羊血清的PBS緩沖液中30min；去除上述阻斷液（不要漂洗）；孵育切片于一抗溶液中（小鼠抗大鼠P物質(zhì)抗體，購自abcam公司，稀釋度為1：500；兔抗大鼠NK1受體抗體，購自Sigma公司，稀釋度為1：200，均稀釋于含0.3%Triton x-100和5%正常山羊血清的PBS緩沖液中）室溫下過夜；漂洗切片于0.01mol/L的PBS緩沖液中3×10min；分別孵育切片于不同二抗溶液中（FITC標(biāo)記的兔抗小鼠IgG抗體，TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（購自Sigma公司），稀釋度為1：500，稀釋于含0.3%Triton x-100和5%正?；蛲蒙窖蜓宓腜BS緩沖液中）室溫下2h；漂洗切片于0.01mol/L的PBS緩沖液中3×10min；將切片用50%甘油（甘油和PBS緩沖液等體積混合）裱于經(jīng)APES處理過的載玻片上，蓋上蓋玻片。免疫標(biāo)記后，切片用Zeiss Axiophot 2顯微鏡（德國）觀察，用數(shù)碼相機(jī)及其配套軟件Spot 32（美國）攝取圖像，F(xiàn)ITC在（激發(fā)470nm，釋放520nm）激發(fā)下發(fā)出綠光，圖像獲得后，用Metamorph4.0軟件（美國）進(jìn)行圖像定量分析。所有分析由一個(gè)對(duì)實(shí)驗(yàn)分組和處理情況不知情的分析者完成。P物質(zhì)在結(jié)腸肌層中的陽性面積百分?jǐn)?shù)（即陽性面積占肌層面積的百分?jǐn)?shù)）：在5×物鏡視野下獲取結(jié)腸切片圖像，用Metamorph4.0軟件進(jìn)行分析，將圖像放大至原圖像的200%，設(shè)置灰度閾值，超過此閾值的灰度被確定為陽性，再選定整個(gè)肌層范圍，可得到選定肌層范圍的面積和此范圍內(nèi)陽性面積，用肌層范圍內(nèi)陽性面積除以肌層面積，得到肌層中P物質(zhì)陽性面積百分?jǐn)?shù)。P物質(zhì)在脊髓背角或中腦的陽性面積：在10×物鏡視野下獲取整個(gè)脊髓背角或中腦的圖像，用Metamorph4.0軟件進(jìn)行分析，設(shè)置灰度閾值，超過此閾值的灰度被確定為陽性，得到雙側(cè)背角或中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（PAG）及中縫背核（DR）的P物質(zhì)陽性面積，結(jié)果表示為μm2/雙側(cè)背角或μm2/中腦PAG及DR。NK1受體陽性肌間神經(jīng)叢的數(shù)目：在20×物鏡視野下觀察計(jì)數(shù)整個(gè)切片中陽性肌間神經(jīng)叢的數(shù)目。NK1受體在脊髓背角或中腦的表達(dá)：NK1受體免疫反應(yīng)在脊髓背角的分布范圍用半定量評(píng)分來衡量，因?yàn)镹K1免疫反應(yīng)分布于Ⅰ層、Ⅲ～Ⅴ層、靠近中央管的Ⅹ層或中腦PAG及DR等區(qū)域，設(shè)定評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：一個(gè)區(qū)域有免疫反應(yīng)為1分；兩個(gè)區(qū)域有免疫反應(yīng)為2分；三個(gè)區(qū)域有免疫反應(yīng)為3分；更多區(qū)域有免疫反應(yīng)為4分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，NK1受體在脊髓背角或中腦的表達(dá)用Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗(yàn)，其它指標(biāo)均數(shù)間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1結(jié)腸中P物質(zhì)免疫反應(yīng)的分布和表達(dá) 在大鼠結(jié)腸中，P物質(zhì)免疫反應(yīng)性主要分布于肌層，環(huán)肌層有P物質(zhì)陽性神經(jīng)纖維，肌間神經(jīng)叢有P物質(zhì)陽性神經(jīng)元和纖維；黏膜下層也有P物質(zhì)免疫反應(yīng)性。定量分析發(fā)現(xiàn)，母嬰分離組和對(duì)照組在CRD前后，肌層P物質(zhì)陽性面積百分?jǐn)?shù)在各組間無明顯差異（P＞0.05）（表1）。

2.2結(jié)腸中NK1受體免疫反應(yīng)的分布和表達(dá) 結(jié)腸中NK1受體免疫反應(yīng)主要存在于肌間神經(jīng)叢。定量分析發(fā)現(xiàn)，母嬰分離組和對(duì)照組在CRD前后，NK1受體免疫反應(yīng)陽性肌間神經(jīng)叢數(shù)目無明顯差異（P＞0.05）（表2）。

2.3脊髓背角P物質(zhì)免疫反應(yīng)分布和表達(dá) P物質(zhì)免疫反應(yīng)分布于脊髓背角淺層。定量分析發(fā)現(xiàn)，母嬰分離組和對(duì)照組在CRD前后，脊髓背角P物質(zhì)陽性面積無明顯差異（P＞0.05）（表1）。

2.4脊髓背角NK1受體免疫反應(yīng)的分布和表達(dá) NK1受體在脊髓背角廣泛分布，濃集分布于淺層，在深層和靠近中央管區(qū)域有陽性神經(jīng)元和突起。定量分析發(fā)現(xiàn)，母嬰分離組和對(duì)照組在CRD前后，脊髓背角NK1受體分布積分無明顯差異（P＞0.05）（表2）。

2.5中腦PAG及DR的P物質(zhì)免疫反應(yīng)分布和表達(dá) P物質(zhì)免疫反應(yīng)分布于中腦PAG及DR。定量分析發(fā)現(xiàn)，母嬰分離組和對(duì)照組在CRD前后，中腦PAG及DRP物質(zhì)陽性面積無明顯差異（P＞0.05）（表1）。

表1　母嬰分離組和對(duì)照組大鼠腦腸軸P物質(zhì)的表達(dá)（x±s）

表2　母嬰分離組和對(duì)照組大鼠腦腸軸NK1受體的表達(dá)（x±s）

2.6中腦PAG及DR的NK1受體免疫反應(yīng)的分布和表達(dá) NK1受體在中腦PAG及DR散在分布，有陽性神經(jīng)元和突起。定量分析發(fā)現(xiàn)，母嬰分離組和對(duì)照組在CRD前后，中腦PAG及DRNK1受體分布積分無明顯差異（P＞0.05）（表2）。

3　討論

P物質(zhì)和NK1受體在內(nèi)臟痛傳輸和調(diào)節(jié)方面起重要作用。鑒于P物質(zhì)在傷害性刺激時(shí)被初級(jí)感覺神經(jīng)釋放至外周（腸）和中樞（脊髓及腦干），在外周參與致痛，在中樞參與致敏，而且外周炎癥時(shí)脊髓背角和腸壁中P物質(zhì)和/或NK1受體的表達(dá)量發(fā)生改變，NK1受體拮抗劑對(duì)炎癥和應(yīng)激所致內(nèi)臟感覺過敏起抑制作用，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了內(nèi)臟傷害性刺激（CRD）時(shí)結(jié)腸和脊髓及中腦水平P物質(zhì)和NK1受體的分布和表達(dá)。結(jié)果顯示，在結(jié)腸肌層（包括肌間神經(jīng)叢）中，P物質(zhì)和NK1受體的分布和表達(dá)量在母嬰分離組和對(duì)照組無明顯差異。腸道中的P物質(zhì)大多來自內(nèi)在腸神經(jīng)，少數(shù)來自外在感覺神經(jīng)（迷走和脊髓感覺神經(jīng)）纖維，后者將內(nèi)臟信息傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)［4］，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以判斷外在感覺神經(jīng)纖維中P物質(zhì)的分布和表達(dá)有無改變。外在初級(jí)感覺神經(jīng)的細(xì)胞體位于背根神經(jīng)節(jié)和節(jié)狀神經(jīng)節(jié)，這些神經(jīng)元有無P物質(zhì)表達(dá)的改變有待研究。

在脊髓背角及中腦PAG及DR，母嬰分離組大鼠P物質(zhì)和NK1受體免疫反應(yīng)的分布及表達(dá)和對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示在脊髓及中腦水平P物質(zhì)的釋放和NK1受體的激活在母嬰分離組大鼠和對(duì)照組大鼠可能無明顯差異。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：母嬰分離組大鼠在結(jié)腸擴(kuò)張前后，其結(jié)腸和脊髓背角及中腦P物質(zhì)和NK1受體免疫反應(yīng)的分布和表達(dá)與對(duì)照組比較均未見明顯差異，對(duì)此結(jié)果的可能解釋有：（1）IBS是一種功能性疾病，目前還未發(fā)現(xiàn)特異性的生化和結(jié)構(gòu)異常，國內(nèi)有報(bào)道IBS患者腸道黏膜中P物質(zhì)免疫反應(yīng)神經(jīng)纖維表達(dá)增加［1，5］；但最近發(fā)現(xiàn)感染后IBS患者結(jié)腸黏膜P物質(zhì)表達(dá)增加，而非感染IBS患者結(jié)腸黏膜P物質(zhì)表達(dá)與對(duì)照組無明顯差異［6］。而且P物質(zhì)和NK1受體主要在炎癥相關(guān)傷害性感受中起作用，這方面的證據(jù)來自P物質(zhì)和NK1受體在炎癥過程中的表達(dá)改變，NK1受體拮抗劑對(duì)炎癥所致內(nèi)臟感覺過敏動(dòng)物模型的作用和基因敲除小鼠對(duì)炎癥所致內(nèi)臟傷害性感受的缺陷［7］。而本動(dòng)物模型是以中樞神經(jīng)機(jī)制（新生期心理應(yīng)激）為主介導(dǎo)的模型，無感染/炎癥的發(fā)生和參與，這可能是本動(dòng)物模型無P物質(zhì)和NK1受體改變的原因之一。（2）本實(shí)驗(yàn)在結(jié)腸和脊髓及中腦3個(gè)層面檢測(cè)了P物質(zhì)和NK1受體的表達(dá)，其在腦的表達(dá)有無改變及具體部位尚不清楚。中樞神經(jīng)系統(tǒng)P物質(zhì)通路在內(nèi)臟高敏感大鼠直腸擴(kuò)張刺激時(shí)被激活，血漿及脊髓上部位P物質(zhì)含量發(fā)生改變［8］，可能通過杏仁核，海馬和前扣帶回等部位激活而起效應(yīng)，但也有發(fā)現(xiàn)IBS患者皮層和皮層下區(qū)的廣泛區(qū)域的P物質(zhì)和NK1受體的失調(diào)不甚明顯［9］。因此，本母嬰分離動(dòng)物模型中脊髓及中腦有無P物質(zhì)和NK1受體的改變有待進(jìn)一步研究。

1 Ma XP，Tan LY，Yang Y，et al.Effect of electro-acupuncture on substance P，its receptor and corticotropin-releasing hormone in rats with irritable bowel syndrome. World J Gastroenterol，2009，15（41）：5211～7.

2 Bian ZX.Novel insights about the mechanism of visceral hypersensitivity in maternally separated rats.Neurogastroenterol Motil，2012，24（7）：593～6.

3 Coutinho SV，Plotsky PM，Sablad M，et al.Neonatal maternal separation alters stress-induced responses to viscerosomatic nociceptive stimuli in rat.Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol，2002，282（2）：G307～G316.

4 Holzer P， Holzer-Petsche U. Tachykinins in the gut. Part I. Expression，release and motor function.Pharmacol Ther，1997， 73（3）： 173～217.

5 王艷杰，王德山，關(guān)洪全，等.眼針對(duì)腸易激綜合征大鼠血清和結(jié)腸組織中P物質(zhì)及血管活性腸肽含量的影響.針刺研究，2010，35（1）：8～11.

6 魏良洲，鞠輝，戴素美，等.感染后腸易激綜合征患者結(jié)腸黏膜P物質(zhì)與白細(xì)胞介素、干擾素表達(dá)的相關(guān)性研究.中華消化雜志，2006，26（9）：586～589.

7 Okano S，Ikeura Y，Inatomi N.Effects of tachykinin NK1 receptor antagonists on the viscerosensory response caused by colorectal distention in rabbits.J Pharmacol Exp Ther，2002，300（3）：925～31.

8 Liang C，Luo H，Liu Y，et al.Plasma hormones facilitated the hypermotility of the colon in a chronic stress rat model.PLoS One，2012，7（2）：e31774.

9 Jarcho JM，F(xiàn)eier NA，Bert A，et al.Diminished neurokinin-1 receptor availability in patients with two forms of chronic visceral pain.Pain，2013，154（7）：987～996.

Objective To study the expression and distribution of substance P and its receptor along brain-gut axis in neonatal maternal separation rats. Methods Male neonatal Sprague-Dawley rats were randomly divided into 2 groups： Maternal separation（MS）group exposed to a 3-hour daily maternal separation or Non-handling（NH）control group exposed to no handling on postnatal day 2-21. Colorectal distension（CRD）was performed in these rats in adulthood. Distal colon and lumbar-sacral spinal cord and midbrain were harvested for semi-quantitative analysis of substance P and NK1 receptor expression using immunohistochemical methods before and after CRD. Results None of the elements of substance P system was altered by maternal separation. There was no significant difference in substance P positive area percentage、the number of NK1 receptor positive myenteric plexus、substance P positive area in dorsal horn、the NK1 positive score in dorsal horn、periaqueductal gray（PAG）and raphe nucleus（DR）of midbrain 、the NK1 positive score in PAG and DR（P＞0.05）. Conclusion s Neonatal maternal separation has no significant effect on the expression of substance P and NK1 receptor，suggesting that substance P system play little role in the development of visceral hyperalgesia in neonatal maternal separation rat models.

Visceral hypersensitivity Neonatal maternal separation Substance P NK1 receptor

浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012C37032）

321000 浙江大學(xué)金華醫(yī)院內(nèi)鏡中心（滕衛(wèi)軍）

321007金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院（丁明星）

321000 浙江省金華市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（方遠(yuǎn)書）

310058 浙江大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所（方馬榮）