16S rRNA基因檢測在自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎早期診斷中的應(yīng)用

張興翔　金　敏

16S rRNA基因檢測在自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎早期診斷中的應(yīng)用

張興翔金敏

目的 探討16S rRNA基因檢測在快速診斷自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎（SBP）中的臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法 通過對細(xì)菌16S rRNA基因保守區(qū)和變異區(qū)的序列分析，設(shè)計(jì)通用引物，對已知實(shí)驗(yàn)室病原菌、人類基因組DNA、巨細(xì)胞病毒和白色假絲酵母菌進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增，檢測方法的特異性；采用倍比稀釋法進(jìn)行方法敏感性檢測。對SBP患者的腹水同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和普通培養(yǎng)，比較兩種方法的陽性率。結(jié)果 已知菌株均獲得920bp 擴(kuò)增產(chǎn)物，人類基因組 DNA、巨細(xì)胞病毒和白色假絲酵母菌無相應(yīng)產(chǎn)物，敏感性能達(dá)到1pg 大腸埃希菌DNA。PCR法陽性率顯著高于培養(yǎng)法（P＜0.05）。結(jié)論 PCR技術(shù)檢測腹水病原菌16S rRNA基因，具有特異性強(qiáng)，敏感度高等特點(diǎn)，在早期、快速診斷SBP方面具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

16S rRNA基因 聚合酶鏈反應(yīng) 自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎

自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎（SBP）是肝硬化失代償期和重型肝炎常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，也是導(dǎo)致肝功能惡化的常見原因之一，SBP能導(dǎo)致病情惡化和患者死亡，在臨床積極治療下病死率仍高達(dá)20%～30%。因此，早期、快速診斷和及時(shí)治療是挽救患者生命的關(guān)鍵［1］。傳統(tǒng)的腹水培養(yǎng)法耗時(shí)長，陽性率較低，16S rRNA基因檢測方法具有檢測耗時(shí)短、陽性率高等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　臨床資料

1.1一般資料 選擇本院感染科和消化內(nèi)科2012年1月至2014年12月間住院疑似SBP患者49例。其中男28例，女21例；年齡37～82歲，平均年齡（56.0±14.5）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2000年西安全國傳染病與寄生蟲病會(huì)議制訂的標(biāo)準(zhǔn)［2］。

1.2標(biāo)本來源 在無菌條件下抽取腹水20ml，10ml接種于培養(yǎng)瓶用于普通細(xì)菌培養(yǎng)，10ml保存于-20℃冰箱。

1.3引物設(shè)計(jì)與合成 引物由上海生物工程公司合成： 上游為 5 ＇AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3 ＇；下游 為 5 ＇ CCGTCAATTCCTTTGAGTTT 3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為920bp。

1.4試劑與儀器 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）反應(yīng)試劑由大連寶生物工程公司提供，PCR儀為PE公司提供，DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀由北京六一儀器廠提供，Gel doc 1000成像系統(tǒng)由美國 Bio-Rad 公司提供。

2　結(jié)果

2.1PCR方法特異性分析 8株已知病原菌經(jīng)PCR方法擴(kuò)增后均獲得920bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，但人類基因組DNA、巨細(xì)胞病毒、白色假絲酵母菌和空白對照無相應(yīng)產(chǎn)物，見圖1。

圖1　已知病原菌PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物電泳圖

2.2 PCR方法的敏感性分析 已知濃度的大腸埃希菌DNA經(jīng)無菌水10倍倍比稀釋后經(jīng)PCR方法擴(kuò)增，最低濃度可達(dá)1pg。

2.3兩種方法的陽性率比較 培養(yǎng)法陽性率為14.29%，PCR方法陽性率為36.73%，PCR方法陽性率顯著高于培養(yǎng)法（P＜0.05），見表1。

表1　兩種方法敏感性比較（n）

3　討論

SBP是指無腹腔臟器穿孔、炎癥或損傷而發(fā)生的急性細(xì)菌性腹腔感染，腸道病原菌過度繁殖、腸黏膜屏障破壞、宿主免疫功能缺陷是SBP發(fā)生的三大危險(xiǎn)因素。目前，SBP的確診主要依據(jù)是腹水病原菌培養(yǎng)和腹水實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查，但SBP腹水細(xì)菌培養(yǎng)陽性率較低，即使腹水中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥ 0.25×109/L的腹水，其培養(yǎng)陰性率也高達(dá)65%，并且培養(yǎng)法耗時(shí)較長，一般需要3～5d［3］。近年來，隨著分子生物學(xué)發(fā)展，16S rRNA基因檢測技術(shù)在醫(yī)學(xué)方面的廣泛應(yīng)用，使其在SBP患者腹水病原菌快速檢測中成為一種重要方法。

16S rRNA基因序列結(jié)構(gòu)完整，總長度適中，存在于所有細(xì)菌基因組中，不存在于病毒、真菌等非原核生物中。因此，在細(xì)菌學(xué)研究中16S rRNA基因常被作為研究的靶分子。李慶等［4］將16S rRNA基因檢測技術(shù)應(yīng)用于新生兒敗血癥早期診斷，細(xì)菌培養(yǎng)法陽性率為11.3%，PCR方法陽性率為26.8%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。邱建達(dá)［5］應(yīng)用16S rRNA基因檢測慢性前列腺炎患者前列腺液中病原菌，細(xì)菌培養(yǎng)法為10.31%，PCR方法檢測陽性率為59.79%，PCR方法敏感性顯著高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法。汪峰等［6］運(yùn)用16S rRNA 寬范圍聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測臨床無菌體液標(biāo)本，PCR方法陽性率為15.9%，培養(yǎng)法陽性率為9.6%，16S rRNA 寬范圍 PCR方法具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。潘紅英等［7］用定量PCR聯(lián)合基因芯片技術(shù)檢測SBP患者腹水中細(xì)菌16S rRNA基因診斷自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎，細(xì)菌培養(yǎng)法陽性率為7.9%，PCR方法陽性率為22.4%，PCR方法陽性率顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法，并且PCR方法能將病原菌區(qū)分為革蘭陽性或革蘭陰性菌，有利于臨床針對病原菌及時(shí)經(jīng)驗(yàn)用藥。駱歡等［8］應(yīng)用PCR技術(shù)檢測肝硬化患者腹水標(biāo)本，細(xì)菌培養(yǎng)法陽性率為5.41%，PCR方法陽性率為24.32%，PCR方法陽性率顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法陽性率（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明，16S rRNA基因檢測技術(shù)檢測SBP患者的腹水標(biāo)本陽性率為36.73%，普通細(xì)菌培養(yǎng)法陽性率為14.29%，16S rRNA基因檢測技術(shù)陽性率顯著高于細(xì)菌培養(yǎng)法（P＜0.05），其檢測下限低至1pg 大腸埃希菌DNA，達(dá)到臨床要求。

總之，16S rRNA基因檢測技術(shù)在快速診斷SBP具有特異性強(qiáng)，敏感性高等特點(diǎn)，在早期、快速診斷SBP方面具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 Riggio O，Angeloni S. Ascitic fluid analysis for diagnosis and monitoring of spontaneous bacterial peritonitis. World J Gastroenterol，2009， 15（31）：3845～3850.

2 中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案.傳染病信息，2000，13（4）：141～142.

3 Wiest R，Krag A，Gerbes A.Spontaneous bacterial peritonitis： recent guidelines and beyond.Gut，2012，61（2）：297～310.

4 李慶，王濤，范春燕，等.16S rRNA基因檢測在新生兒敗血癥早期診斷中的應(yīng)用. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2012，22（21）：4696～4697.

5 邱建達(dá). PCR技術(shù)在前列腺液細(xì)菌檢測中的應(yīng)用. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志， 2012，22（7）：1535～1537.

6 汪峰，劉彩林，廖亞龍，等.應(yīng)用16S rRNA 寬范圍聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測臨床無菌體液感染.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26（12）：865～868.

7 潘紅英，諶翠容，尚世強(qiáng)，等.定量PCR聯(lián)合基因芯片檢測腹水細(xì)菌16SrRNA診斷自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎.中華肝臟病雜志，2011，19（4）：297～300.

8 駱歡，李國航，瞿志軍，等.應(yīng)用16S rRNA基因研究肝硬化患者腸道和腹水中菌群分布.當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2011，17（23）：5～6.

Objective To explore the clinical application value of detection 16S rRNA gene in the rapid diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis（SBP）. Methods Universal primers were designed through a known pathogen of a conservative district and variation of 16S rRNA gene sequence analysis. The specifi city was detected through PCR amplifying known pathogen，human genomic DNA，cytomegalovirus and Candida albicans.The sensitivity was detected through doubling dilution. The ascites were done by PCR Method and culture Method at the same time，the positive rate was compared by the two Method s. Results The known pathogen were amplifi ed and products were 920bp，but human genomic DNA，cytomegalovirus and Candida albicans showed no corresponding products. Sensitivity showed that it could detect as low as 1 pg of Escherichia coli. DNA.The positive rate of PCR Method was signifi cantly higher than that of culture Method（P＜0.05）. Conclusion The technology of PCR has strong specifi city and high sensitivity，it has important clinical application value in early and rapid diagnosis SBP.

16S rRNA gene Polymerase chain reaction（PCR） Spontaneous bacterial peritonitis（SBP）

310000 杭州市西湖區(qū)第二人民醫(yī)院

1.5反應(yīng)體系和條件 PCR反應(yīng)體系為2.5mmol/L dNTPs 4μl，25 mmol/L Mgcl24μl，10×Buffer 5μl，20μmol/L引物各1μl，5U/μl Taq酶0.25μl，模板5.0μl，加無菌雙蒸餾水至50μl。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性6min，94℃變性45s，54℃退火lmin，72℃2min共循環(huán)30次，最后延伸10min。

1.6擴(kuò)增產(chǎn)物分析 將擴(kuò)增產(chǎn)物2μl與1μl上樣緩充液混勻后，加樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），經(jīng)100V電壓電泳30 min，將電泳后的瓊脂糖凝膠放置在凝膠圖像分析儀上，紫外線透射掃描觀察并拍照保存。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。