移植物動脈硬化模型大鼠血管平滑肌細胞原代培養及鑒定

張遠標　尚敏杰　王知非　洪德飛　王偉林　鄭躍英★

移植物動脈硬化模型大鼠血管平滑肌細胞原代培養及鑒定

張遠標尚敏杰王知非洪德飛王偉林鄭躍英★

目的 探討大鼠腹主動脈移植后，血管平滑肌細胞（VSMC）的分離、培養方法。方法 建立BN至Lewis腹主動脈移植的慢性排斥反應、動脈硬化模型，60d后用組織塊貼壁方法分離、培養血管平滑肌細胞并進行傳代。采用形態學和肌動蛋白免疫組化鑒定證實為VSMC。結果 細胞呈典型的“峰-谷”樣生長，歷次傳代鑒定均為高純度VSMC，傳代至6代左右仍能保持原有性狀，細胞活力未見減低。結論 組織塊貼壁法培養大鼠腹主動脈移植后VSMC具有操作簡單、細胞活力高、純度高等優點，可作為研究器官移植慢性排斥反應、移植物動脈硬化新的體外實驗模型。

大鼠 腹主動脈移植 血管平滑肌 培養 組織塊貼壁法

近年來器官移植短期存活率已經得到明顯的提高，但慢性排斥反應導致移植物慢性失功，一直是影響移植物長期存活的主要原因之一［1～3］。慢性排斥反應具有一個共同的組織學表現即移植物動脈硬化［4］，其主要特征是血管平滑肌細胞（VSMC）增殖和細胞外基質增生所致的閉塞性動脈病變。臨床上移植物3年動脈硬化的累積發生率達40%，5年則高達50%［5］，故深入研究移植物動脈硬化的發生機制，對防治移植物慢性失功具有重大意義。本課題通過建立移植物慢性排斥反應動脈硬化模型，原代分離培養血管平滑肌細胞，并進行純化鑒定，為今后移植物慢性失功的防治提供新的思路和理想的體外實驗模型。

1　材料和方法

1.1材料 （1）動物：實驗大鼠為健康清潔級BN和Lewis大鼠，均為雄性，6～8周，體重165～220g，購于北京偉通利華實驗動物技術有限公司。（2）主要器械和試劑：顯微外科用顯微鏡，放大倍數10倍（Olympus），顯微外科器械、常規外科手術器械以及8-0和11-0無損傷顯微外科縫合線（均購于華東醫療器械有限公司），倒置顯微鏡（Olympus） 25cm2塑料培養瓶（Costar），優質胎牛血清（JRH公司），高糖DMEM（Gibco公司），抗平滑肌細胞α肌動蛋白單克隆抗體（Sigma公司）。100U/ml肝素生理鹽水，100U/ml肝素乳酸林格氏液，1%戊巴比妥鈉。

1.2大鼠腹主動脈移植慢性排斥動脈硬化模型的建立 根據Hillebrands等的報道［5］，建立BN→Lewis大鼠腹主動脈移植慢性排斥動脈硬化模型。（1）供體取材：BN大鼠稱重后以1%的戊巴比妥鈉按0.4ml/100g腹腔注射，備皮，常規消毒鋪巾，依次切開皮膚、皮下肌層、腹膜，將胃腸推向右中下腹并用無菌濕紗布覆蓋，充分暴露手術視野。手術過程中經常用溫鹽水滴濕紗布以防胃腸道干燥。消毒棉簽鈍性撕開腹膜后脂肪，顯露下腔靜脈和腹主動脈輪廓，打開動靜脈鞘，銳性分離下腔靜脈和腹主動脈，遇有血管分支時，11-0顯微外科縫合線結扎離斷。自左腎動脈分支到髂血管分岔處，完整游離腹主動脈。切取這一段長約1.5～2.5cm之腹主動脈，肝素生理鹽水沖洗動脈管腔，放入100U/ml肝素乳酸林格液中，置于4℃冰箱。（2）腹主動脈移植：受鼠Lewis大鼠，完全分離腹主動脈步驟同（1），在兩個止血夾之間切除長約1cm的腹主動脈，肝素生理鹽水沖洗上下殘端動脈腔。11-0縫合線采用間斷縫合法行血管移植，一般每個吻合口各縫8～10針，邊距0.3 mm，避免血管扭曲。吻合過程中，經常以肝素生理鹽水沖洗管腔，避免空氣進入。縫合結束，消毒棉簽壓迫2～3min，檢查血管充盈情況。撤除紗布，觀察無活動性出血，逐層關腹。腹腔內注射林格液20ml/kg，以恢復血容量［6］。

1.3 移植物血管平滑肌細胞的分離、培養 （1）細胞培養：術后60d斷頸處死大鼠，75%酒精浸泡3min，移入超凈臺托盤內。十字切口剪開皮膚，換剪刀剪開腹壁及腹膜，消毒棉簽撥開腸子，鈍性暴露下腔靜脈和腹主動脈，顯微剪從近心端開始銳性分離下腔靜脈和腹主動脈，剪下移植段血管，移入有預冷雙抗PBS（青霉素100U/ml，鏈霉素100mg/ml）的玻璃培養皿內，左手持眼科鑷夾住血管一端，右手顯微彎鑷撕下血管外脂肪、結締組織和血凝塊，沖洗2遍。移入另一個含高糖DMEM的玻璃培養皿內，顯微鑷仔細剝離動脈外膜。縱行剖開血管，消毒棉簽或者眼科彎鑷輕柔刮除血管內膜（圖1A）。由于慢性排斥反應，內膜增厚，有時可以用顯微鑷直接撕脫，剩下的中膜組織較薄，透明、易橫斷。雙抗PBS反復沖洗，以去除脂滴、血凝塊等雜質以及可能殘留的內皮細胞和外膜成纖維細胞。將中膜血管組織移入另一個含DMEM的玻璃培養皿中，眼科剪仔細剪成1mm×1mm大小的組織塊（圖1B），再次用雙抗PBS沖洗2遍。用吸管吸取組織塊，吹打至事先鋪有鼠尾膠原（本實驗室自制）的培養瓶底，均勻擺置，使組織塊間距約0.5cm。直立培養瓶，加入20%胎牛血清的培養液5ml，蓋好瓶蓋，放入37℃培養箱內，使瓶底向上。0.5h后緩慢翻轉培養瓶，使組織塊完全浸入培養液，繼續靜置培養，換液1次/3d。動作輕柔，確保細胞游離出前組織塊不脫落。（2）移植段血管VSMC的傳代培養：待大部分組織塊有細胞游離出并與周圍細胞接觸時，此時細胞大約長滿培養瓶的70%～80%，便可進行傳代。吸棄培養液，用PBS沖洗培養瓶底1次，加入0.25% 1ml胰酶，覆蓋瓶底，放入37℃培養箱約2min后，倒置顯微鏡下見細胞觸角回縮、細胞間隙增大時直立培養瓶，使細胞脫離消化液。吸棄胰酶，加入含有胎牛血清的培養液4～5ml終止消化并輕柔反復吹打，使細胞脫壁為單細胞懸液。吸取50%細胞懸液至新的培養瓶中，補足培養液（每瓶5ml左右）。如果初次傳代過程中只有少數的組織塊有細胞游離出，此時待組織塊周圍長滿細胞，可以將細胞消化至六孔板中繼續培養。因為在培養瓶中如果細胞密度過低，細胞不易成活。原代細胞首次胰酶消化時間較短，等傳代數次后消化時間大致一樣。脫落的組織塊會隨下次細胞換液、傳代而除去。（3）VSMC的凍存和復蘇：傳代細胞次數過多可造成細胞衰老或者細胞性狀的改變，因此需要在早期進行充足的凍存。細胞凍存前1d換液1次，以保證細胞有良好的狀態。凍存時依次將凍存管置于4℃ 0.5h，-20℃2h，-80℃過夜，最后直接浸入液氮。建議凍存液的血清濃度＞50%，按此方法凍存的細胞復蘇后成活率高，性狀恢復較快，可較好的用于實驗。

2　結果

2.1細胞生長形態 由于取材時鼠齡已較大，故細胞從組織塊邊緣游離出時間比國內學者報道要晚一些，一般在10～15d大部分組織塊周圍有細胞游離出，細胞形態不一，呈梭形、星形、多角形及不規則形，大小也略有差異（圖1C）。細胞核多呈卵圓形，少數有雙核或多核，核仁1個或者多個，胞漿豐富略透明，細胞相互之間常有突起連接。細胞簇之間連接成網狀。原代細胞胞體較小，傳代數次以后突起稍多，胞質伸展，細胞扁平，邊界不清楚。當細胞長滿時，可見典型的“峰-谷”樣生長（圖1E、F），“峰”處細胞較多，疊層，有時可達4～5層；“谷”處細胞層數較少，有時僅單層細胞甚至無細胞，此時也像“火山口”狀（圖1G）。傳至6代，免疫組化見細胞性狀無明顯改變（×400）（圖1H）。

2.2VSMC鑒定 采用單克隆小鼠抗-α-SM-actin免疫組化鑒定，證實＞95%細胞為血管平滑肌細胞：鏡下觀察染色后的細胞爬片，見胞漿中大量平行的絲條狀染成棕黃色，細胞核不染色（圖1D）。

3　討論

慢性排斥反應移植物動脈硬化的發生是一個涉及VSMC功能及形態發生改變的多因素參與的過程［3，4］。VSMC是血管壁的主要細胞成分之一，是移植物動脈硬化發病中的主要效應細胞，其是決定血管活性和血管構型的重要因素，VSMC功能狀態的改變在慢性排斥反應時移植物動脈硬化中發揮極其重要的作用。因此研究移植物慢性排斥反應動脈硬化VSMC的作用和功能變化，通過各種手段干預VSMC的活化與增殖，是目前治療移植物慢性排斥反應具有重要價值的研究方向和研究熱點［7］。

國外已經建立了多種VSMC細胞系［8］。平滑肌細胞培養方法常見的有酶消化法和組織塊貼壁法。酶消化法常用的有膠原酶、彈力酶、透明質酸酶和胰酶等［9］，可以在短時間內得到大量的活細胞，但是采用此法需要的血管較多，膠原酶價格較高，操作步驟較多，污染的幾率也相對增加。相比之下，采用組織塊貼壁法培養大鼠VSMC具有操作簡便、經濟有效、重復性好等優點。

大鼠腹主動脈移植后血管平滑肌細胞的培養，與普通的大鼠血管平滑肌細胞的培養不同。后者使用的鼠齡較小，培養成活率較高；而前者因為構建慢性排斥反應模型需要近60d［5］，此時鼠齡較大，而且移植段血管較短（1.5～2.0cm），取材量受到限制。培養時需注意：（1）取材時盡量在移植段血管兩端預留一點原受體血管組織，待內外膜剝離干凈后再剪除，以免在操作過程中眼科鑷直接夾傷移植段血管。（2）去除血凝塊和結締組織、PBS沖洗后直接將血管放在DMEM中剝離內外膜，以避免組織塊的活力受損。（3）內外膜能否剝離干凈是影響平滑肌細胞純度的關鍵因素，外膜的剝離可以先在顯微鏡下練習，然后在肉眼下練習，最后在超凈臺內操作，逐漸達到熟練操作。動作要輕柔，避免牽拉過度。由于慢性排斥反應，內膜普遍增厚，容易辨認，因此內膜可以用棉簽刮凈，甚至可用顯微鑷整塊撕除。（4）組織塊盡量剪平整，1mm×1mm大小，擺放均勻。本實驗發現，鏡下邊緣很光滑的組織塊更易游出細胞。（5）翻瓶時間是本實驗成敗最關鍵的因素，時間越長，細胞游出所需時間越久。本實驗使用鼠尾膠原預處理培養瓶，可以確保在30min之內翻瓶而且組織塊不會漂起，而目前國內文獻報道一般平均的翻瓶時間在4h左右［10］。實驗證實，使用鼠尾膠原處理的培養瓶，平均10～15d就會有細胞游離，而使用未處理的培養瓶，4h翻瓶，幾乎均在20d左右才能游離出細胞。（6）關于細胞純化問題，國內有學者報道使用自然純化法、機械刮除法、差異貼壁法等［11］。仔細分離外膜后，內膜由于排斥反應增厚容易分離，多次原代培養鑒定均為高純度VSMC。國外學者也已經證明，即便早期有少許內皮細胞，隨著傳代次數的增加，VSMC的優勢生長，內皮細胞會逐漸消失。

綜上所述，組織塊貼壁法培養大鼠腹主動脈移植后血管平滑肌細胞具有簡便、經濟、純度高等優點，經形態學以及免疫組織化學鑒定均為高純度VSMC。傳代6代左右細胞形態性狀未發生明顯改變。早期凍存，復蘇后繼續傳代生長，細胞性狀不變。這為器官移植排斥、移植物慢性失功的基礎研究提供了新的體外實驗模型。

1 Sood S， Testro AG.Immune monitoring post liver transplant.World J Transplant，2014，4（1）：30～39.

2 van den Hoogen P，Huibers MM，Sluijter JP，et al. Cardiac allograft vasculopathy： a donor or recipient induced pathology.J Cardiovasc Transl Res，2015，8（2）：106～116.

3 Li J，Liu S， Li W，et al. Vascular smooth muscle cell apoptosis promotes transplant arteriosclerosis through inducing the production of SDF-1α. Am J Transplant，2012，12（8）：2029～2043.

4 Costello JP， Mohanakumar T， Nath DS.Mechanisms of chronic cardiac allograft rejection.Tex Heart Inst J，2013，40（4）：395～399.

5 Hillebrands JL，Rozing J.Chronic transplant dysfunction and transplant arteriosclerosis： New insights into underlying mechanisms. Expert Rev Mol Med，2003，5（2）：1～23.

6 Isik FF， McDonald TO， Ferguson M， et al. Transplant arteriosclerosis in a rat aortic model. Am J Pathol，1992，141（5）：1139～1149.

7 Beazley KE， Zhang T， Lima F， et al.Implication for transglutaminase 2-mediated activation of β-catenin signaling in neointimal vascular smooth muscle cells in chronic cardiac allograft rejection.J Heart Lung Transplant，2012，31（9）：1009～1017.

8 Kennedy E， Hakimjavadi R， Greene C， at al.Embryonic rat vascular smooth muscle cells revisited - a model for neonatal， neointimal SMC or differentiated vascular stem cells.Vasc Cell，2014，6（1）：6.

9 Ginnan R，Zou X，Pfleiderer PJ，et al.Vascular smooth muscle cell motility is mediated by a physical and functional interaction of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase IIδ2 and Fyn. J Biol Chem，2013，288（41）：29703～29712.

10 張嗚號，王秀玉，曹軍.組織塊貼壁法原代培養人臍血管平滑肌細胞的改良.寧夏醫科大學學報，2011，33（12）：1229～1231.

11 倪偉，劉濤，王浩宇，等.酶聯合消化法培養小鼠主動脈平滑肌原代細胞.醫學理論與實踐，2013，26（13）：1681～1683.

To explore a method for isolating and culturing vascular smooth muscle cells （VSMC） after rat abdominal aortic transplantation. Methods The chronic rejection model of abdominal aortic transplantation was established using BN rats as donors and Lewis rats as recipients. Two months later，the allograft was harvested and VSMCs were isolated and cultured by explanting culture method. VSMC were identified by morphology and the immunohistochemical SABC method （α-SMActin）. Results The cultured VSMC showed typical “peak-valley” pattern and kept high purity and original activity after nearly 6 passages. Conclusion Tissue culture is a simple method for isolating and culturing VSMC after rat abdominal aortic transplantation，and the VSMC can remain high activity and high purity. It may provide a new model to study the chronic rejection and allograft arteriosclerosis in organ transplantation in vitro.

Rat Culture Tissue Culture Technique Abdominal Aortic Transplantation Vascular Smooth Muscle Cell

圖1　A：移植段血管外膜與中膜可以清晰的剝離；B：血管剪成大小1mm×1mm組織塊；C：貼壁15d，可見細胞自組織塊邊緣游出；鏡下見：細胞形態不一，呈梭形、星形、多角形及不規則形，大小也略有差異（×200）。D：α-SMA肌動蛋白免疫組織化學檢測結果（S-P法），＞95%的細胞呈陽性反應，即鏡下觀察染色后的細胞爬片，見胞漿中大量平行的絲條狀染成棕黃色，細胞核不染色。細胞核多呈卵圓形，少數有雙核或多核，核仁1個或者多個，胞漿豐富略透明，細胞相互之間常有突起連接（×400）。E-F：貼壁20d，可見細胞間相互融合生長，隱約可見“峰-谷”樣生長（E×200，F×400）；G：傳至6代，可見典型的“峰-谷”樣生長，“峰”處細胞較多，疊層，有時可達4～5層；“谷”處細胞層數較少，有時只有單層細胞甚至無細胞，此時也像“火山口”狀（×200）；H：傳至6代，免疫組化見細胞性狀無明顯改變（×400）

310014 浙江省人民醫院肝膽胰外科（張遠標 尚敏杰王知非 洪德飛）

310003浙江大學醫學院附屬第一醫院衛生部多器官聯

合移植研究重點實驗室（王偉林）

310003浙江大學醫學院附屬第一醫院麻醉科（鄭躍英）