補(bǔ)腎護(hù)肝法對大鼠酒精性脂肪肝的保護(hù)作用

朱星瑜　管斯琪　傅天嘯　劉　瀟　陳　卓

·基礎(chǔ)研究·

補(bǔ)腎護(hù)肝法對大鼠酒精性脂肪肝的保護(hù)作用

朱星瑜管斯琪傅天嘯劉瀟陳卓

目的 觀察補(bǔ)腎方對酒精性脂肪肝模型大鼠血清酶活力及肝臟指數(shù)的影響，探討本處方對酒精性脂肪肝的保護(hù)作用。方法 以56°紅星二鍋頭酒（10ml/kg，2次/d，連續(xù) 8周）的方法建立酒精性脂肪肝大鼠模型。8周后將造模成功大鼠分為模型對照組、海王對照組（金樽海王片）、補(bǔ)腎方（熟地、巴戟天、仙靈脾）高、中、低劑量組，分別以（3.0g/ml）10ml/（kg·d）、（1.5g/ml）10ml/（kg·d）、（0.75g/ml）10ml/（kg·d）灌胃處理；模型對照組用等量的蒸餾水，連續(xù)給藥4周，同期設(shè)正常對照組。給藥結(jié)束后，禁食12 h，取肝臟檢測肝臟指數(shù)，門靜脈取血檢測血清 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活力。 結(jié)果 與空白組比較，模型組肝臟指數(shù)、γ-GT、ALT及AST 活力顯著升高（P＜0.05），體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）； 中藥高、中、低劑量組、海王組肝臟指數(shù)、γ-GT、ALT及AST 活力較模型組顯著性降低（P＜0.05），體質(zhì)量顯著性上升（P＜0.05）。 結(jié)論 補(bǔ)腎方能降低γ-GT、ALT、AST活力，減少肝臟脂肪的蓄積，降低對肝細(xì)胞的損傷，對酒精性脂肪肝確有保護(hù)作用。

補(bǔ)腎方 酒精性脂肪肝 γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶 谷丙轉(zhuǎn)氨酶

酒精性肝病是由于長期大量飲酒所致的肝臟疾病。酒精性脂肪肝（AFL）是酒精性肝病中最早出現(xiàn)、最為常見的病變。若不及時有效控制將會發(fā)展成為各種病變，嚴(yán)重威害健康。AFL是酒精性肝病的初期可逆階段［1］，作者選用補(bǔ)腎方，通過中醫(yī)理論補(bǔ)腎養(yǎng)肝，利用熟地、巴戟天、仙靈脾煎劑干預(yù)酒精性脂肪肝大鼠模型。給藥4周后觀察大鼠的形態(tài)，解剖立取肝臟檢測肝臟指數(shù)，并于門靜脈采血分離血清，檢測血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（γ-GT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）的水平，觀察補(bǔ)腎方對大鼠酒精性脂肪肝是否具有保肝作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 52只6周齡雄性SD大鼠，體重（180±20）g。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.2儀器與實(shí)驗(yàn)環(huán)境 TDL-4 低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），F(xiàn)J200-S高速均漿機(jī)（上海標(biāo)本模型廠），SK-1 混勻器（常州國華電器有限公司），OLYMPUS AU640全自動生化分析儀（日本奧林巴斯光學(xué)株式會社），大鼠屏障系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)飼養(yǎng)室，溫度（22±1）℃，濕度（60±10）%，噪音＜50dB，光照150～200Lx，12h明暗交替。

1.3藥品 補(bǔ)腎方煎劑的制備：煎劑由熟地30g、巴戟天15g、仙靈脾15g組成，加水浸泡2h，煎沸30min/次，煎煮2次，合并煎液，靜置，取上清液，加熱濃縮成含生藥為3.0g/ml的制劑，4℃冰箱保存。飲片由浙江省中醫(yī)院藥房提供；海王金樽片（深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司）；紅星二鍋頭酒（北京釀造總廠），ALT 試劑盒、AST試劑盒、γ-GT試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.4分組及造模方法 同日購進(jìn)52只6周齡雄性SD大鼠，體重（180±20）g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將52只大鼠隨機(jī)分成空白組和模型組，其中空白組10只，模型組42只。模型組用56°紅星二鍋頭酒按10ml/ kg灌胃，上午及下午各1次（每次大致相隔10～12h），連續(xù)8周；空白組用等量蒸餾水灌胃，灌胃時間相同，連續(xù)8周。所有大鼠均采用常規(guī)飼料及飲水。8周后分別從空白組和模型組中隨機(jī)抽取大鼠2只，脊椎脫臼處死，立刻取肝臟，經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)造模成功［2］。第9周起，將40只造模成功的大鼠隨機(jī)分為5組，分別為模型對照組、中藥高、中、低劑量組和海王組，每組8只，該5組及空白組仍然按照之前的方法喂養(yǎng)。中藥高劑量組用熟地、巴戟天、仙靈脾煎劑（3.0g/ml）10ml/（kg·d）灌胃處理；中藥中劑量組用煎劑（1.5g/ ml）10ml/（kg·d）灌胃處理；中藥低劑量組用煎劑（0.75g/ ml）10ml/（kg·d）灌胃處理，海王組用金樽海王片按1.5g/kg灌胃處理，模型對照組和空白組用等量的蒸餾水，方式均為灌胃。每周稱重，根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況適當(dāng)調(diào)整用藥量。

2　結(jié)果

2.1大鼠一般情況 正常組大鼠毛色潤澤，活動敏捷，能迅速對外界刺激做出反應(yīng)，正常飲食飲水，大便量、質(zhì)均正常，生長正常。模型組大鼠灌酒后反應(yīng)變遲鈍，甚至對外界刺激無應(yīng)答，行動遲緩，活動減少表現(xiàn)為嗜睡。灌胃4周出現(xiàn)毛色黃暗無光澤，進(jìn)食飲水均減少，體質(zhì)量變化不明顯甚至減輕，糞便有酒味。

2.2體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的變化 與正常組比較，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降，而肝臟指數(shù)顯著上升（P＜0.05）。用藥后，中藥三組和海王組體質(zhì)量較模型組顯著上升，而肝臟指數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見該中藥與海王金樽片均取得療效。見表1。

表1　各組大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)比較（x±s）

2.3補(bǔ)腎方對血清酶活力的影響 與空白組比較，模型組γ-GT、ALT及AST活力顯著上升（P＜0.05），可見模型組大鼠肝臟確有損傷； 與模型組比較，中藥各組及海王組γ-GT、ALT及AST活力顯著下降（P＜0.05），可見兩種藥物對大鼠酒精性脂肪肝均有保護(hù)作用。見表2。

表2　各組大鼠γ-GT、ALT、AST活力比較（x±s）

3　討論

酒味甘、辛、苦，性溫?zé)幔墒娼罨罱j(luò)，止痛散寒，溫通經(jīng)脈［3］。中醫(yī)認(rèn)為酒為水谷所釀，乃谷食之精氣，其性濕熱，其氣剽悍，入心、肝、肺、胃經(jīng)，并指出酒有大毒。隨著社會生活的發(fā)展和人們生活方式的改變，酗酒者不斷增多，酒精性脂肪肝的發(fā)生也呈現(xiàn)迅速上升的趨勢。中醫(yī)歷代經(jīng)典中并無與酒精性脂肪肝相對應(yīng)的病名，通過分析酒精性脂肪肝的臨床證候和癥狀，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載描述，應(yīng)屬肝積、肝雍、肥氣、痞氣、積氣等病范疇［4］。酒精性脂肪肝的形成，是由于酒熱濕毒之邪損傷中焦脾胃，中焦氣機(jī)不暢，而致土壅木郁。肝脾同病，則清陽不升而濁陰不降。氣機(jī)運(yùn)行不利則血行不暢，故此病常表現(xiàn)出氣滯血瘀、濕阻郁熱等證候癥狀。

現(xiàn)代研究表明，酒精在肝內(nèi)代謝，主要通過微粒體氧化酶和乙醇脫氫酶兩大系統(tǒng)，代謝過程中產(chǎn)生的乙醛會導(dǎo)致還原型輔酶I增多，從而抑制脂肪酸氧化，三酰甘油在肝內(nèi)形成過多導(dǎo)致脂肪肝。過量的乙醛和脂質(zhì)過氧化可直接損傷肝細(xì)胞，形成酒精性脂肪肝［5］。γ-GT 被認(rèn)為是診斷酒精性肝損害較為敏感且具有一定特異性的指標(biāo)［6］，血清中的γ-GT主要來源于肝膽系統(tǒng)，大量持續(xù)飲酒可引起γ-GT升高［7］。肝細(xì)胞被破壞后 ALT 和 AST 會被釋放至血液中，使血清中 ALT、AST 活力增加［8］。ALT 和 AST 活力是肝細(xì)胞損傷最敏感指標(biāo)之一［9］。

中醫(yī)學(xué)根據(jù)五行學(xué)說，將五臟進(jìn)行歸屬，以木、火、土、金、水對應(yīng)五臟，以五行特性來說明五臟的生理活動特點(diǎn)，并根據(jù)五行之間相互的生克制化關(guān)系，說明并解釋人體五臟之間生理功能的內(nèi)在聯(lián)系，取自然現(xiàn)象“水能生木”來進(jìn)行類比，提出“腎（水）之精以養(yǎng)肝（木）”的理論［10］。肝血的滋生依賴于腎精，腎藏精，精可化血，同時腎主骨生髓，骨中精髓又可與血液相互化生轉(zhuǎn)換，滋養(yǎng)肝血，故通過補(bǔ)腎中藥治療肝病具有一定的科學(xué)性。錢英重視“肝腎同源”在慢性肝病中的應(yīng)用，臨床上治療慢性肝病中即提出“肝病固腎”的觀點(diǎn)，認(rèn)為“見肝之病，其源在腎，急當(dāng)固腎”［11］。王靈臺等［12］認(rèn)為臨床上各類慢性肝病雖各自有異，但都具有“腎虛證”的共同表現(xiàn)，提出補(bǔ)腎是慢性肝病治療過程中的重要治療法則，并符合肝病的病理機(jī)制。李瀚旻等［13］探討了補(bǔ)腎方（左歸丸）對同種異性骨髓移植小鼠肝再生相關(guān)信號通路的影響，其研究結(jié)果證實(shí)左歸丸可同時對多個信號通路產(chǎn)生影響，說明中醫(yī)學(xué)補(bǔ)腎法對肝再生具有促進(jìn)和調(diào)節(jié)作用。余文景等［14］通過實(shí)驗(yàn)研究肝腎歸經(jīng)中藥的水溶性成分（地黃多糖、車前子多糖、淫羊藿多糖、菟絲子多糖）對大鼠肝臟干細(xì)胞生長、分化情況的影響，證實(shí)特定濃度下可促進(jìn)成體大鼠肝臟干細(xì)胞的增殖，亦是“肝腎同源”理論的應(yīng)用。

長期飲酒過量，會使人體內(nèi)陽熱盛、生痰濕，釀成濕熱。這一認(rèn)識與朱丹溪經(jīng)臨床實(shí)際體會提出“陽常有余，陰常不足”的論說具有一致性。熟地補(bǔ)陰益精以生血，為養(yǎng)血補(bǔ)虛之要藥。陰虛導(dǎo)致陽盛，滋陰以補(bǔ)陰虛，生血以助行氣，有利于祛濕散熱；巴戟天和仙靈脾均具有補(bǔ)腎助陽、強(qiáng)筋壯骨和祛風(fēng)除濕的功效，陽能化濕，而腎又主一身陰陽之根本，通過補(bǔ)腎陽以達(dá)到助陽化濕的目的。因此該補(bǔ)腎方對酒精性脂肪肝具有保護(hù)效果，對指導(dǎo)臨床具有一定的意義。

1 姚鳳云，楊偉鵬，肖洪彬，等.肝加欣片對酒精性肝損傷大鼠肝組織病理學(xué)改變的影響.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12（12）：54.

2 羅華麗，周萍，賈劍鋒，等.雙葛解酲丸對大鼠酒精性脂肪肝的保護(hù)作用.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（4）：180～182.

3 邱皓，呂曉云，劉文，等.中藥活血利濕方對酒精性腎損害的干預(yù)作用.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（18）：187.

4 范建高，曾民德，主編.脂肪性肝病.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005. 85～100.

5 蘇俊.酒精性肝病105例臨床分析.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2007，3（5）：704.

6 金鳳影.γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的測定對酒精性肝炎的診斷價值.中國實(shí)用醫(yī)藥，2009，4（13）：149.

7 陳艷，吳鐵，陳文雙.紅苓肝寶對小鼠酒精性肝損害的保護(hù)作用.廣東醫(yī)學(xué)，2009，30（10） ：1444.

8 邸琳，劉新宇，金向群，等.酒肝清膠囊對實(shí)驗(yàn)性大鼠酒精性脂肪肝的治療作用.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2008，14（3）：53.

9 黃俊杰，王彩冰，黃麗娟，等.bFGF對慢性酒精中毒大鼠血清ALT、AST活性的影響.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2010，17（27）：7.

10 王耀光.“肝腎同源”論初探.中醫(yī)雜志，2008，49（1）：5～7.

11 張秋云，張潤順.錢英教授肝病固腎經(jīng)驗(yàn)的臨床應(yīng)用研究.中華中醫(yī)藥學(xué)會第十五屆內(nèi)科肝膽病學(xué)術(shù)會議暨國家中醫(yī)藥管理局專科專病協(xié)作組（肝病組、傳染病組）會議論文匯編，2012.

12 王靈臺，陳建杰，高月求，等.補(bǔ)腎法為主治療慢性肝病的臨床研究A首屆國際中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會議論文匯編，2005.

13 李瀚旻，桂文甲，李晶津，等.左歸丸對同種異性骨髓移植小鼠肝再生相關(guān)基因信號通路的影響.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（31）：6069～6073.

14 余文景.地黃多糖、車前子多糖、淫羊藿多糖及菟絲子多糖對成體大鼠肝臟干細(xì)胞生長影響的研究.成都中醫(yī)藥大學(xué)，2010.

Objective To observe the kidney prescription in the serum enzyme activity of alcoholic fatty liver model rats and the effect on the liver function，to explore the protection effect of the prescription of alcoholic fatty liver. Methods 56 degrees hongxing spirit erguotou wine ig（10 ml/kg，2 times/d，for 8 weeks）method to establish the rat model with alcoholic fatty liver. After 8 weeks ， the rats model were divided into control group and treatment control group（ with Haiwangjinzun drug），kidney prescription treatment groups（prepared rhizome of rehmannia，medicinal indianmulberry root，a fairy spleen）high，medium and low dose group，respectively with（3.0g/ml）10ml/（kg·d）、（1.5g/ml）10ml/（kg·d）、（0.75g/ml）10ml/（kg·d）lavage treatment；Model control group with the same amount of distilled water，for 4 weeks in a row，at the same time establish normal control group.12 h after the treatment，fasting，liver detection index，liver portal vein blood serum detection，serum gammaglutamine transferase（γ-GT），aspertate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT）activity. Results For the liver function index in the model group，gamma GT，ALT and AST activity were higher than normal control group significantly（P＜0.05），body quality was significantly lower（P＜0.05）； in the high，medium and low dose of Chinese medicine group，western medicine group liver index，γ-GT，ALT and AST activity were significantly lower in the model group（P＜0.05），body quality significantly increased（P＜0.05）. Conclusion The kidney prescription of Chinese traditional medicine can reduce γ-GT，ALT，AST，reduce the accumulation of hepatic fat，reduce the damage in liver cells，thus having protective effect on the alcoholic fatty liver.

Kidney prescriptions Alcoholic fatty liver Gamma glutamine transferase Aspertate aminotransferase Alanine aminotransferase

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計(jì)劃暨新苗人才計(jì)劃（2013R410048）

310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)（朱星瑜 管斯琪 傅天嘯）310053 浙江中醫(yī)藥大學(xué)濱江學(xué)院（劉瀟 陳卓）

1.5指標(biāo)檢測 （1）肝臟指數(shù)：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對各組大鼠進(jìn)行稱量，取血后立即采用脊柱脫臼法處死，取肝臟，測量各組大鼠肝臟質(zhì)量，肝臟指數(shù)計(jì)算公式：肝臟指數(shù) = 肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。（2）血液指標(biāo)：給藥4周后，禁食12h（不禁水），門靜脈采血6ml離心分離血清。以2500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分別取上清液20μl測定γ-GT、ALT和AST 活力。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，通過重復(fù)測量方差的統(tǒng)計(jì)方法，將各組之間各項(xiàng)指標(biāo)水平進(jìn)行比較和對照，若方差齊則采用 LSD 檢驗(yàn)，方差不齊則采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。