從“腦心同病”探討急性腦缺血引發(fā)心肌損傷的動態(tài)變化

劉雪梅　陶冶　傅晨　王鳳麗　鄭宏　張允嶺

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·論著·

從“腦心同病”探討急性腦缺血引發(fā)心肌損傷的動態(tài)變化

劉雪梅陶冶傅晨王鳳麗鄭宏張允嶺

目的觀察腦缺血不同時間引發(fā)心肌損傷的變化，明確“腦心同病”的生物學基礎(chǔ)。方法電凝法致大腦中動脈閉塞建立急性腦缺血誘發(fā)心肌損傷大鼠模型，隨機分為正常組、假手術(shù)組、缺血6小時模型組、缺血12小時模型組和缺血24小時模型組，每組9只，記錄心電圖分析心率變異性，ELISA法測定血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme，CK-MB)活性、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponinI，cTnI)含量，HE染色法觀察腦、心組織形態(tài)學變化，HBFP染色法觀察心肌纖維形態(tài)學變化。結(jié)果急性腦缺血明顯降低中頻段、高頻段、總頻段，中頻段與高頻段比值隨缺血時間延長呈逐漸上升趨勢；隨腦缺血時間延長，CK-MB、CTnI呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，在缺血6小時達高峰；腦缺血6小時出現(xiàn)神經(jīng)細胞腫脹、結(jié)構(gòu)不清，部分胞核縮小并深染等缺血改變，隨腦缺血時間延長逐漸加重，至腦缺血24小時神經(jīng)細胞數(shù)目明顯減少，結(jié)構(gòu)形態(tài)破壞嚴重。心肌細胞胞漿著色不均，心肌嗜酸性變；腦缺血6小時心肌纖維廣泛、彌漫親復(fù)紅染色，心肌發(fā)生早期病變，隨腦缺血時間延長心肌病變逐漸縮小、程度減輕。結(jié)論急性腦缺血能夠引發(fā)心肌損傷，心肌發(fā)生早期病變，心肌酶譜發(fā)生異常，可增加心肌酶活性、cTnI含量，在腦缺血6小時達到高峰，證實了腦心同病的生物學基礎(chǔ)。

急性腦缺血；心肌損傷；腦心同病

在中老年人群中，腦、心缺血性疾病普遍存在，且往往同時或先后發(fā)生而集于一身，可稱之為腦心同病。目前臨床發(fā)現(xiàn)缺血性腦卒中伴發(fā)無癥狀冠心病的患者比率高達16.7%[1]；急性心梗并發(fā)腦卒中的發(fā)病率從1.0%～8.6%不等[2]，可見腦心同病在臨床是較為常見的現(xiàn)象，在治療上常采取相同的治療方法，達到了良好的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)心腦血管疾病發(fā)病部位雖然不同，但有著諸多相同的危險因素或相似的發(fā)病機制。本研究采用電凝致大腦中動脈閉塞方法,建立急性腦缺血大鼠模型，在此基礎(chǔ)上動態(tài)檢測血清心肌酶活性，觀察心率變異性及心肌細胞、纖維病理形態(tài)學改變，以證實急性腦缺血對心肌的損傷作用，明確腦心同病的發(fā)病機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物

清潔級健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量(220±20) g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2主要試劑、儀器。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride,TTC)購自FLUKA;CK-MB、cTnI試劑盒購自RB公司。

電凝器(AESCULAP tb50)、雙極電凝鑷(TIMESCO)、自動脫水機及石蠟包埋機、切片機(LEICA)、正置顯微鏡(OLYMPUS)、多導(dǎo)電生理記錄儀(Biopac Systems)、酶標儀(Bio-Teck ELx800)。

1.3動物分組及局灶性腦缺血模型造模方法

實驗大鼠隨機分為正常組、假手術(shù)組、缺血6小時模型組、缺血12小時模型組、缺血24小時模型組，共5組,每組9只。手術(shù)前12小時禁食、不禁水。

參照Tamura方法[3]并做相應(yīng)改進，開顱電凝大鼠大腦中動脈，制備局灶性急性腦缺血模型。將大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉(3.5 mL/kg)，左側(cè)臥位固定大鼠于手術(shù)臺，右顳入路，沿顴弓下緣做一1.5 cm長的皮膚切口，鈍性分離顳肌，切除少許下頜骨冠突，暴露鱗狀骨、上頜骨，小骨鉆鉆孔，打開2×4 mm2骨窗，劃開硬腦膜，清晰暴露右側(cè)大腦中動脈近側(cè)段。電凝嗅束與大腦下靜脈之間的大腦中動脈主干近側(cè)段，造成供血相關(guān)區(qū)梗塞灶，記錄梗塞開始時間。假手術(shù)組除不電凝大腦中動脈外，其他操作與模型組相同。

1.4觀測指標

1.4.1心率變異性分析各組大鼠在各時間點麻醉，大鼠右上、左下、右下肢皮下分別插入與MP100生理儀相連的不銹鋼針形電極，記錄心電圖信號。連續(xù)記錄ECG信號120秒，獲取低頻段(low frequency band，LF，0.04～0.20 Hz)、中頻段(midium frequency band，MF，0.21～0.60 Hz)、高頻段(high frequency band，HF，0.61～3.00 Hz)、總功率(total power，TP，0.04～3.00 Hz)，并計算中頻段與高頻段比值(MF/HF)。

1.4.2血清肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB isoenzyme,CK-MB)活性、肌鈣蛋白I(cardiac troponinI, cTnI)含量測定各組大鼠腹主動脈取血，4℃ 3500 rpm離心10分鐘取上清。采用ELISA法，按試劑盒說明書進行操作。

1.4.3腦組織形態(tài)學觀察各組大鼠心臟灌注固定后取出大腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中進行固定。常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，制成4 μm厚度的石蠟切片。切片進行二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，0.5%伊紅復(fù)染，酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察大腦皮層缺血區(qū)及其周圍組織病理形態(tài)學變化。

1.4.4心肌組織形態(tài)學觀察各組大鼠麻醉后快速摘取心臟，置于4%多聚甲醛中固定。心肌組織脫水、包埋、HE染色方法同上。光鏡下觀察心肌組織的病理學變化。

1.4.5心肌纖維形態(tài)學觀察心肌組織固定、脫水、包埋及切片等步驟同HE染色。常規(guī)脫蠟水化處理后，明礬蘇木素染色，流水沖洗返藍，0.1%堿性復(fù)紅染色，純丙酮脫水，0.1%苦味酸丙酮分化，純丙酮脫水，酒精脫水，二甲苯透明,中性樹膠封片。光鏡下觀察心肌組織的病理學變化。

表1　大鼠心率變異性變化

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01。

1.5統(tǒng)計學處理

2　結(jié)果

2.1腦缺血不同時間對心率變異性分析

假手術(shù)組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，腦缺血6小時、12小時、24小時模型組MF、HF、TF均明顯下降(P<0.01)，缺血各組之間差異無統(tǒng)計學意義。LF、MF/HF值各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但隨腦缺血時間延長MF/HF比值存在逐漸上升趨勢。見表1。

2.2腦缺血不同時間對CK-MB活性和cTnI含量變化

CK-MB活性變化：假手術(shù)組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，腦缺血6小時模型組CK-MB活性明顯增強(P<0.01)；腦缺血12小時模型組較缺血6小時模型組CK-MB活性有所降低，但仍高于假手術(shù)組(P<0.01)；腦缺血24小時模型組CK-MB活性接近假手術(shù)組基礎(chǔ)值水平，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2　大鼠血清CK-MB活性、cTnI含量變化

注： 與假手術(shù)組比較，aP<0.01。

cTnI含量變化：假手術(shù)組與正常組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與假手術(shù)組相比，腦缺血6小時模型組cTnI含量明顯升高(P<0.01)；腦缺血12小時、24小時模型組cTnI含量接近假手術(shù)組水平，與假手術(shù)組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.3腦缺血不同時間對神經(jīng)細胞形態(tài)學變化

正常及假手術(shù)組：神經(jīng)細胞數(shù)目多，形態(tài)結(jié)構(gòu)清楚，胞漿豐富，胞核呈藍色，核仁清晰可見；腦缺血6小時、12小時、24小時模型組的神經(jīng)細胞均可見不同程度的腫脹，細胞間隙增寬，出現(xiàn)細胞水腫現(xiàn)象，缺血12小時出現(xiàn)神經(jīng)細胞數(shù)目減少，核仁消失，至缺血24小時時神經(jīng)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)顯著破壞，脫失嚴重，核固縮，核仁不可見。見圖1。

A.假手術(shù)組

B.腦缺血6小時模型組

C.腦缺血12小時模型組

D.腦缺血24小時模型組

圖1腦缺血不同時間大鼠腦組織形態(tài)學改變(HE染色，×200)

2.4腦缺血不同時間對心肌細胞形態(tài)學變化

正常及假手術(shù)組：心肌細胞形態(tài)正常，肌原纖維排列有序，染色鮮艷均一，腦缺血6小時、12小時、24小時模型組的細胞胞漿著色不均，心肌嗜酸性改變，小部分心肌細胞胞核輕微固縮，出現(xiàn)凝固性壞死；可見收縮帶、波狀纖維。缺血24小時較缺血6小時、12小時胞漿著色不均范圍減少。見圖2。

2.5腦缺血不同時間對心肌纖維形態(tài)學變化

正常組及假手術(shù)組心肌纖維呈金黃色，心肌細胞胞核呈藍色，心肌細胞間質(zhì)中紅色點狀顆粒為紅細胞；腦缺血6小時、12小時、24小時模型組均可見心肌纖維親復(fù)紅染色呈不同程度紅色，其中缺血6小時心肌纖維親復(fù)紅染色廣泛、彌漫分布，色深紅，提示大量的心肌組織發(fā)生了早期病理改變；隨著腦缺血時間延長，心肌纖維親復(fù)紅染色逐漸變淡，提示早期病變的心肌組織隨著腦缺血時間延長而開始部分恢復(fù)。見圖3。

A.假手術(shù)組

B.腦缺血6小時模型組

C.腦缺血12小時模型組

D.腦缺血24小時模型組

圖2腦缺血不同時間心肌組織形態(tài)學改變(HE染色，×200)

A.假手術(shù)組

B.腦缺血6小時模型組

C.腦缺血12小時模型組

D.腦缺血24小時模型組

圖3腦缺血不同時間心肌組織形態(tài)學改變(HBFP染色，×200)

3　討論

心率變異性(heart rate variability，HRV)是指竇性心律在一定時間內(nèi)周期性改變的現(xiàn)象，可定量評估心臟交感神經(jīng)、迷走神經(jīng)的張力以及兩者的均衡性對心血管活動的影響[4]，其降低可作為心律失常和心源性猝死的獨立預(yù)報指標[5-6]。HRV由LF、MF和HF三個譜峰組成，MF受心臟交感與副交感神經(jīng)活動的雙重影響；HF是檢測心臟副交感神經(jīng)活性的定量指標；MF/HF比值反映心臟交感和副交感神經(jīng)活動的平衡。本實驗結(jié)果顯示，腦缺血后6～24小時MF、HF波段功率明顯降低，且隨缺血時間延長下降愈明顯，說明交感、副交感神經(jīng)功能受損。隨腦缺血時間延長植物神經(jīng)功能受損越嚴重，心臟可能因此發(fā)生繼發(fā)性損傷。既往臨床、實驗研究也證實大腦中動脈阻塞患者表現(xiàn)出MF、HF降低，MF/HF比值升高的現(xiàn)象[7-8]。

肌鈣蛋白是心肌損傷的特異性和敏感性指標[9]，具有高度的心肌特異性；肌酸激酶同工酶為心肌特異性酶，在評判心肌損傷上有較好的靈敏度。本研究采用cTnI與CK-MB聯(lián)合評價心肌的損傷程度，結(jié)果顯示腦缺血早期心肌酶活性增強，說明在腦缺血超早期心肌損傷已明確存在。在形態(tài)學上同時發(fā)現(xiàn)腦缺血后心肌細胞出現(xiàn)間質(zhì)水腫，心肌纖維受損。提示腦缺血早期容易造成心肌損傷，隨著腦缺血時間延長心肌病變減輕。這與文獻報道亦一致，急性腦卒中后肌鈣蛋白水平增加并有心肌缺血的心電圖改變，而且增加死亡危險性，其機制可能與血液循環(huán)中兒茶酚胺水平增加有關(guān)[10]。

課題組認為腦、心缺血性疾病的直接病變部位是絡(luò)脈。中風、胸痹或因年老體衰，或因久病氣血虧損，腦絡(luò)、心絡(luò)失養(yǎng)；瘀血或痰飲內(nèi)停，而致腦絡(luò)、心絡(luò)阻滯不通；情志、瘀血或痰飲郁而化火，進一步損傷腦絡(luò)、心絡(luò)，腦絡(luò)損傷發(fā)為中風，心絡(luò)損傷發(fā)為胸痹[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)急性腦缺血大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損癥狀，梗死周圍區(qū)神經(jīng)細胞水腫、胞漿稀疏淡染，胞核固縮；心肌組織出現(xiàn)缺血缺氧早期病變，心肌酶譜異常，證實了腦絡(luò)損傷進而損傷心絡(luò)。腦絡(luò)損傷，腦功能受損、形質(zhì)敗壞，局部正氣愈虛、邪氣愈盛，熾盛之邪以絡(luò)脈網(wǎng)絡(luò)為通道橫竄心絡(luò)，引起心功能損傷、甚至結(jié)構(gòu)變化。腦、心損傷皆以絡(luò)脈損傷為起始，以功能、結(jié)構(gòu)改變?yōu)榻K點結(jié)局，病絡(luò)機制是腦心同病的共性機制，急性腦缺血誘發(fā)心肌損傷的發(fā)生發(fā)展、相互影響的時空動態(tài)過程體現(xiàn)了病絡(luò)機制的演變規(guī)律和腦心同病的發(fā)病機制。

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(本文編輯： 禹佳)

Dynamic change from the “Naoxin Tongbing” on myocardial injury induced by acute cerebral ischemia

LIUXue-mei,TAOYe,FUChen,etal.

DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100078,China

Correspondingauthor:ZHANGYun-ling,E-mail：yunlingzhang2004@163.com

ObjectiveTo observe the dynamic change of myocardial injury induced by cerebral ischemia, and determine the biological basis of “Naoxin Tongbing”. MethodsRat model of middle cerebral artery occlusion was established by electro-coagulation technique. Rats were randomly divided into five groups: normal group, sham group, ischemia 6 h, 12 h, 24 h model groups. Heart rate variability was recorded by ECG; Creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB) activity, cardiac troponinI(cTnI) content was detected by ELISA; Morphological changes of cerebral tissue was observed by HE staining and HBFP staining. ResultsAcute cerebral ischemia could decrease MF, HF and TF, MF/HF has an increased tendency. Serum CK-MB activity and cTnI content was increased at first and then decreased，which peaked at 6 h of ischemia. HE staining in the cerebral tissues showed the phenomena of disorganization，neurons edema, quantity decreased and nuclear condensation. The cardiac tissue of HE staining showed chromatosis light, mild coagulation necrosis; 6 hours after cerebral ischemia, myocardial fibers were extensive and diffuse, and the early pathological changes were gradually reduced, and the extent of myocardial lesions decreased with the time of ischemia. ConclusionAcute cerebral ischemia could cause myocardial injury and lead to early myocardial change, increased serum CK-MB activity and cTnI content, which peaked at 6h of cerebral ischemia. It was confirmed the biological basis of “Naoxin Tongbing”.

Acute cerebral ischemia；Cardiac injury；Naoxin Tongbing

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2012CB518406);國家國際科技合作專項(2015DFA31130)；國家自然科學基金(81173233)

100078北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院實驗中心[劉雪梅、陶冶、傅晨、王鳳麗、鄭宏、張允嶺]

劉雪梅(1979- )，女，博士，副研究員。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合腦病基礎(chǔ)研究。E-mail：liuxuemei04@126.com

張允嶺(1963- )，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)腦病臨床與機制研究。E-mail:yunlingzhang2004@163.com

R542.2

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.09.004

2016-05-10)