毛細管電泳法同時分離檢測飲料中的六種食品添加劑

代語林，董嬋嬋，鄧　寧*，何建波，王　燕，朱燕舞

（合肥工業大學化學與化工學院，安徽合肥230009）

毛細管電泳法同時分離檢測飲料中的六種食品添加劑

代語林，董嬋嬋，鄧寧*，何建波，王燕，朱燕舞

（合肥工業大學化學與化工學院，安徽合肥230009）

建立毛細管電泳法同時測定飲料中苯丙氨酸、對羥基苯甲酸甲酯、肉桂酸、山梨酸鉀、抗壞血酸和苯甲酸6種食品添加劑的分析方法。在Peakmaster 5.3軟件對電泳參數模擬的基礎上，考察了緩沖液濃度、pH值以及分離電壓對6種食品添加劑分離效果的影響。結果表明，在檢測波長214 nm，進樣時間10 s的情況下，確定最佳電泳條件為40 mmol/L pH 9.0 Na2HPO4-H3PO4的緩沖液，分離電壓12 kV。在此條件下，6種食品添加劑在20～160 mg/L范圍內呈良好的線性關系（R＞0.980 0），檢出限為0.23～0.77 mg/L，加標回收率為97.3%～103.0%，相對標準偏差（RSD）為2.0%～3.8%，精密度試驗結果相對標準偏差（RSD）為2.0%～3.8%，表明該方法操作簡便、準確度高、精密度良好，能滿足飲料中6種食品添加劑的檢測需求。

毛細管電泳；Peakmaster 5.3軟件；食品添加劑；飲料；分離檢測

毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法是以石英毛細管為分離通道，高壓直流電場為驅動力的分離檢測技術。食品添加劑是指為改善食品色、香、味等品質，以及為防腐和加工工藝的需要而加入食品中的人工合成或天然物質［1］。然而食品添加劑的過量使用，將會導致人體生理機能紊亂，給人體健康造成較大危害。因此，建立一種簡單有效地檢測食品添加劑的方法非常重要。目前，食品添加劑的檢測方法常采用氣相色譜（gas chromatography，GC）法［2］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［3-5］和毛細管電泳法［6-8］。相對于GC法和HPLC法來說，CE法樣品預處理簡單，且具有分離效率高、試劑消耗量少、實驗成本低等優點，因此被廣泛應用于食品添加劑的分離檢測。張禮春等［9］應用CE法分離檢測苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯和對羥基苯甲酸丁酯等7種防腐劑。LIU F J等［10］利用CE法分離檢測了飲料中的檸檬酸、水楊酸、苯甲酸、山梨酸和抗壞血酸等5種有機酸。

建立CE法檢測食品添加劑的過程中，通常需要通過實驗考察電泳條件對分離的影響［11-12］，因此方法建立的過程較長。Peakmaster 5.3是一款電泳軟件，可用于預測分析物在毛細管區帶電泳中的行為、計算背景電解質pH值和離子強度等［13-14］，從而節約實驗探索時間、降低分析成本。AZEVEDO M S等［15］應用Peakmaster軟件對馬來酸、丙二酸、甲酸和天門冬酸等10種有機酸進行電泳條件的模擬，在此基礎上，優化實驗條件，從而實現了10種有機酸的分離檢測。

由于Peakm aster 5.3軟件數據庫中沒有對羥基苯甲酸甲酯和山梨酸鉀的相應參數，本研究應用Peakmaster 5.3軟件對苯丙氨酸、肉桂酸、山梨酸、抗壞血酸和苯甲酸5種食品添加劑的電泳條件進行模擬。在參考模擬數據的基礎上，進一步考察緩沖液濃度及其pH值、分離電壓等電泳參數對6種食品添加劑分離的影響，確定分離檢測6種食品添加劑的最佳電泳條件，建立同時分離檢測苯丙氨酸、對羥基苯甲酸甲酯、肉桂酸、山梨酸鉀、抗壞血酸和苯甲酸等6種食品添加劑的毛細管電泳法，為毛細管電泳法同時分離檢測食品添加劑提供了思路和參考價值。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、磷酸（H3PO4，85%）、無水乙醇、苯甲酸、對羥基苯甲酸甲酯、山梨酸鉀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；苯丙氨酸（99%）：阿拉丁試劑有限公司；肉桂酸（99.5%）：上海潤捷化學試劑有限公司；抗壞血酸（99.7%）：廣東汕頭西隴化工公司；水為實驗室自制二次蒸餾水。名仁蘋果醋飲料、銳澳雞尾酒、百事可樂極度、可口可樂零度汽水、可口可樂怡泉檸檬味汽水、脈動和怡寶魔力維他命購自大型超市。

1.2儀器與設備

CL1020型高效毛細管電泳儀：北京彩陸科學儀器有限公司；紫外檢測器、高壓電源和CT-22色譜信號采集單元：上海千譜軟件公司；內徑50 μm未涂層石英毛細管：河北永年銳灃色譜器件有限公司；PHS-3CT型pH計：上海大中分析儀器廠；BSM-200.4型電子天平：上海卓精電子科技有限公司；KQ-100E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；CZ-93自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠。

1.3方法

1.3.1溶液配制

標準溶液的配制：準確稱取苯丙氨酸、抗壞血酸各100 mg于2個小燒杯中，用二次蒸餾水溶解并分別轉移到2個50 m L容量瓶中，定容至刻度，配制成2 mg/m L的標準儲備液。準確稱取苯甲酸、山梨酸鉀和對羥基苯甲酸甲酯各100 mg于3個小燒杯中，用無水乙醇溶解并分別轉移至3個50 m L容量瓶中，定容至刻度，配制成2 mg/m L的標準儲備液。準確稱取200 mg的肉桂酸于小燒杯中，用無水乙醇溶解并分別轉移至50 m L容量瓶中，定容至刻度，配制成4 mg/m L的標準儲備液。分別用1、2、3、4、5和6表示苯丙氨酸、對羥基苯甲酸甲酯、肉桂酸、山梨酸鉀、抗壞血酸和苯甲酸這6種食品添加劑，R1-2、R2-3、R3-4、R4-5、R5-6分別表示電泳譜圖中出峰次序相鄰食品添加劑之間的分離度。使用分離度作為分離程度的衡量標準，分離度R的計算公式如下：

式中：tR為遷移時間，min；W為以時間表示的色譜峰底寬度；min；下標1、2分別代表相鄰兩個溶質。

緩沖溶液的配制：準確稱取一定量的Na2HPO4于100m L燒杯中，用二次蒸餾水溶解，用0.01mol/LH3PO4溶液調節pH至9.0，并定容至50 m L容量瓶中，配制成40 mmol/L pH 9.0 Na2HPO4-H3PO4的緩沖液。

所有溶液在使用前進行超聲脫氣并用0.45 μm濾膜過濾。

1.3.2樣品處理

對名仁蘋果醋飲料、銳澳雞尾酒、百事可樂極度、可口可樂零度汽水、可口可樂怡泉檸檬味汽水、脈動和怡寶魔力維他命試驗樣品分別進行超聲處理，除去其中的氣體，用二次蒸餾水進行適當的稀釋，所得溶液用0.45 μm濾膜過濾后直接進樣分析。

1.3.3石英毛細管電泳法操作條件

電泳條件：毛細管溫度25℃，檢測波長214 nm，進樣高度10 cm，進樣時間10 s。每次進樣前熔融石英毛細管（50 μm×50 cm，有效長度42 cm）依次用1.0 mol/L HCl沖洗5 min、二次蒸餾水沖洗2 m in、1.0 mol/L NaOH沖洗10 m in、二次蒸餾水沖洗2 m in和緩沖液沖洗5 m in。每兩次進樣之間用緩沖液沖洗毛細管5 min。

2　結果與分析

2.1Peakmaster 5.3軟件模擬

運用Peakmaster 5.3軟件對苯丙氨酸、肉桂酸、山梨酸、抗壞血酸和苯甲酸混合體系進行毛細管電泳分離參數模擬，模擬實驗參數如表1所示。

表1　Peakmaster 5.3軟件模擬參數Table 1 Sim ula tion param eters o f Peakm aster 5.3

運行參數和緩沖液濃度及組成通過在軟件界面輸入相應數據和物質得到，系統參數是在運行參數設置之后運行軟件得到。緩沖液分別選擇含有三乙胺、三羥甲基氨基甲烷（Tris）和氫氧化鈉（NaOH）與磷酸（H3PO4）進行模擬，模擬結果表明含有三乙胺和Tris的緩沖液都不能使模擬的5種食品添加劑出峰。最后使5種食品添加劑全部出峰并實現部分分離的緩沖液由80 mmol/L NaOH和40 mmol/L H3PO4組成，pH值9.436，電泳電壓12kV。其中，山梨酸和苯甲酸在模擬條件下部分分離，需進一步進行電泳條件的優化試驗。由于模擬得到pH值是9.436，因此實驗中選擇Na2HPO4溶液、H3PO4調節pH值，得到Na2HPO4-H3PO4緩沖液。

2.2電泳分離條件的確定

2.2.1緩沖液濃度的選擇

在緩沖液pH 9.0、檢測波長為214 nm、分離電壓13 kV、進樣時間10 s的條件下，緩沖液濃度從20 mmol/L逐步增大到60 mmol/L時，6種食品添加劑分離度以及遷移時間的變化情況見圖1。

圖1　緩沖液濃度對分離度（a）和遷移時間（b）的影響Fig．1 Effect of buffer solution concentration on the reso lution（a）and mobility time（b）

由圖1a和圖1b可知，隨著Na2HPO4-H3PO4濃度的增大，6種食品添加劑之間的分離度逐漸增大且遷移時間也隨之增大，這是由于緩沖液離子強度增加，毛細管內雙電層厚度減小，引起電滲流下降［16］。當緩沖液濃度增大到40 mmol/L時，相鄰食品添加劑之間的分離度都達到1.5以上，且在10 min內實現基線分離。繼續增大緩沖液濃度，R3-4、R4-5的分離度＜1.5，且遷移時間逐漸增大，由于毛細管內產生過多焦耳熱的作用，導致峰形變寬，不利于分離。因此，選擇40 mmol/L Na2HPO4-H3PO4溶液作為最佳緩沖液濃度。

2.2.2緩沖液pH值的選擇

在緩沖液為40 mmol/L Na2HPO4-H3PO4、檢測波長214 nm、分離電壓12 kV、進樣時間10 s條件下，緩沖液pH值在8.0～10.0范圍內變化時對6種食品添加劑的分離度和遷移時間的影響，結果見圖2。

圖2　緩沖液pH值對分離度（a）和遷移時間（b）的影響Fig．2 Effect of buffer solution pH on the resolution（a）and mobility tim e（b）

由圖2可知，添加劑3、4、5和6的譜峰遷移時間隨著pH值增大增大而減小，當緩沖液pH值為8.0和8.5時，由于添加劑3、4、5、6遷移時間較長，色譜峰出現展寬現象，而添加劑1和2的遷移時間在pH為8.5時最小，之后隨著pH值的增大而增大；當緩沖液pH值為9.0時，被測物質峰形較好，并且大多數添加劑于10 min內實現了基線分離。當緩沖液pH值為9.5和10.0時，R2-3＜1.5，不能實現基線分離；因此，在綜合考慮分離度和遷移時間的情況下，選擇緩沖液最佳pH值為9.0。

2.2.3分離電壓的選擇

在40 mmol/L pH 9.00 Na2HPO4-H3PO4、檢測波長為214nm、進樣時間為10 s的條件下，調節分離電壓在6～18kV范圍變化時對6種食品添加劑分離度和遷移時間的影響，結果見圖3。

圖3a中最下面一條曲線為R4-5曲線，說明在6種食品添加劑分析過程中，山梨酸鉀和抗壞血酸最難以分離。R4-5只有在電壓為12 kV時＞1.5，即山梨酸鉀、抗壞血酸只有在電壓為12 kV時能實現基線分離。在分離電壓為12 kV時，其他幾種相鄰食品添加劑之間的分離度均＞1.5，達到基線分離。由圖3可知，6種添加劑的遷移時間隨著分離電壓的增大而減小。綜合考慮分離度和遷移時間的情況下，選擇12 kV作為最佳分離電壓。

圖3　分離電壓對分離度（a）和遷移時間（b）的影響Fig．3 Effect of separation voltage on the resolution（a）and m obility tim e（b）

通過對電泳條件的優化，確定6種食品添加劑分離的最佳電泳條件為40 mmol/L pH 9.0 Na2HPO4-H3PO4緩沖液、分離電壓12 kV，在此條件下，6種食品添加劑的毛細管電泳譜圖如圖4所示。由圖4可知，6種食品添加劑在10 min內實現了良好地分離。

圖4　6種食品添加劑毛細管電泳譜圖Fig．4 Electropherogram of six food additives analysis by capillary eletrophoresis

2.3線性回歸方程、相關系數、檢出限和線性范圍分析

在上述的最優電泳條件下，以峰面積（A）為縱坐標，食品添加劑標準品質量濃度（C）為橫坐標，得到6種食品添加劑的標準曲線線性回歸方程、相關系數（R）、檢出限和線性范圍，結果如表2所示。由表2可知，6種食品添加劑的線性相關系數（R）均＞0.980 0，表明峰面積和6種食品添加劑的質量濃度呈良好的線性關系。6種食品添加劑的檢出限為0.23～0.77 mg/L，定量分析的線性范圍為20～160 mg/L。

表2　6種食品添加劑的線性回歸方程、相關系數、檢出限及線性范圍Table 2 Linear regression equation，correlation coefficient，lim its of detection and linear ranges of six food additives

2.4加標回收率試驗

為驗證方法的準確性，以空白為對照，加入相同質量濃度的標準溶液，分別平行測定6次，根據加標量和測定結果計算其加標回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3。由表3可知，6種食品添加劑的加標回收率范圍為97.3%～103.0%，RSD值為2.0%～3.8%，說明該方法準確度可靠，可滿足飲料中6種食品添加劑的分析檢測要求。

表3　加標回收率試驗結果Table 3 Results of add ing standard recovery ra te experim ents

2.5精密度試驗

準確量取標準品，分別平行測定6次，計算6種食品添加劑標準品測定值的平均值和相對標準偏差（RSD），結果見表4。由表4可知，測得6種食品添加劑標準品的相對標準偏差（RSD）為2.0%～3.8%，說明該方法精密度良好。

表4　精密度試驗結果（n=6）Table 4 Results of precision experiments（n=6）

2.6樣品中6種食品添加劑的分析

對名仁蘋果醋飲料、銳澳雞尾酒、百事可樂極度、可口可樂零度汽水、可口可樂怡泉檸檬味汽水、脈動和怡寶魔力維他命等7種市售飲料樣品經過預處理之后，在最佳電泳條件下對其中的6種食品添加劑分別進行分析檢測，每種飲料中6種食品添加劑含量的檢測結果見表5。

表5　7種飲料中6種食品添加劑的檢測結果Table 5 Detection result of six food additives in seven kinds of beverages mg/L

由表5可知，1#、3#和4#飲料中，苯丙氨酸的含量分別為0.88 mg/L、0.93 mg/L和0.88 mg/L，1#、2#和5#飲料中，山梨酸鉀的含量分別為34.43 mg/L、10.90 mg/L和22.26 mg/L，2#和4#飲料中，苯甲酸的含量分別為0.77 mg/L和2.44 mg/L，1#、5#、6#和7#飲料中，抗壞血酸的含量分別為20.19 mg/L、9.30 mg/L、63.98 mg/L和55.33 mg/L，所有添加劑的含量均符合國家相關標準［1］，并且樣品中檢測到的添加劑均與該商品標簽相對應。

3　結論

本研究應用Peakmaster 5.3軟件對苯丙氨酸、肉桂酸、山梨酸、抗壞血酸和苯甲酸的混合樣進行電泳條件的模擬，獲得分離5種食品添加劑的緩沖液組成及濃度、pH值和分離電壓。在此基礎上，分別考察緩沖液濃度及pH值、分離電壓等參數對6種食品添加劑分離的影響，在檢測波長為214 nm、進樣時間10 s的情況下，確定了分離檢測6種食品添加劑的最佳電泳條件為40 mmol/L pH 9.0 Na2HPO4-H3PO4緩沖液，分離電壓12 kV，在此電泳條件下，6種食品添加劑分離效果良好。結果表明，6種食品添加劑在20～160 mg/L范圍內呈良好的線性關系（R＞0.980 0），檢出限為0.23～0.77 mg/L，加標回收率為97.3%～103.0%，相對標準偏差（RSD）為2.0%～3.8%，精密度試驗結果RSD為2.0%～3.8%，該方法具有操作簡單、快速、環境友好、檢測結果可靠等優點，利于推廣使用，因此具有較為廣泛的應用前景，同時為毛細管電泳法分離檢測食品添加劑提供參考。

［1］中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 2760—2014食品安全國家標準添加劑使用衛生標準［S］.北京：中國標準出版社，2014.

［2］SUN Y，WANG X Q，HUANG Y L，et al.Derivatization following hollow-fiber microextraction w ith tetramethylamonium acetate as a dual-function reagent for the determ ination of benzoic acid and sorbic acid by GC［J］.J Sep Sci，2013，36（14）：2268-2276.

［3］王駿，胡梅，張卉，等.超高效液相色譜快速測定飲料中的16種食品添加劑［J］.食品科學，2010，31（2）：195-198.

［4］馬康，蔣孝雄，趙敏，等.高效液相色譜法同時測定軟飲料中20種食品添加劑［J］.分析化學研究報告，2012，40（11）：1661-1667.

［5］黃永輝，余清，林欽，等.超高效液相色譜法同時測定碳酸飲料中的22種食品添加劑［J］.分析測試學報，2011，30（8）：877-882.

［6］郭芳芳，馮鋒，白云峰，等.高效毛細管電泳-紫外檢測法同時檢測雪糕中多種添加劑［J］.食品科學，2015，36（8）：206-210.

［7］王麗芳，丁曉靜，解娜，等.毛細管電泳法測定糖果及調制酒中10種人工合成色素［J］.食品科學，2014，35（14）：145-150.

［8］王鈺，楊思文，代語林，等.毛細管電泳法分離檢測飲料中的防腐劑［J］.中國釀造，2014，33（4）：124-128.

［9］張禮春，曾凱，高舸，等.高效毛細管電泳法同時測定飲料中七種防腐劑［J］.分析實驗室，2015，34（1）：77-80.

［10］LIU F J，DING G S，TANG A N.Simultaneous separation and determ ination of five organic acids in beverages and fruits by capillary electrophoresis using diamino moiety functionalized silica nanoparticles as pseudo stationary phase［J］.Food Chem，2014，145（7）：109-114.

［11］陳桐，丁曉靜，李一正，等.毛細管區帶電泳-間接紫外法快速測定食品中的甜蜜素［J］.色譜，2014，32（6）：666-671.

［12］龍巍然，岑怡紅，王興益，等.毛細管區帶電泳法同時測定飲料中16種食品添加劑［J］.色譜，2012，30（7）：747-751.

［13］HRU KA V，TěDRM，VELáKOVá K，et al.Eigenmobilities in background electrolytes for CZE.V.Intensity（amplitudes）of system peaks［J］.Electrophoresis，2006，27（23）：4610-4617.

［14］張紅醫，梁佳麗，聶中原，等.Peakmaster軟件計算毛細管電泳緩沖液pH和離子強度［J］.計算機與化學，2008，23（4）：43-46.

［15］AZEVEDO M S，PIRASSOL G，FETT R，et al.Screening and determination of aliphatic organic acids in commercial Brazilian sugarcane spirits employing a new method involving capillary electrophoresis and a semi-permanent adsorbed polymer coating［J］.Food Res Int，2014，60（6）：123-130.

［16］武漢大學主編.分析化學（下冊）［M］.第五版.北京：高等教育出版社，2007.

Simultaneous separation and determination of six food additives in beverage by capillary electrophoresis

DAI Yulin，DONG Chanchan，DENG Ning*，HE Jianbo，WANG Yan，ZHU Yanwu
（Schoo l of Chem istry and Chem ical Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

The analysis method of simultaneous determ ination of six food additives（including phenylalanine，methylparaben，cinnam ic acid，potassium sorbate，ascorbic acid and benzoic acid）was established by capillary electrophoresis.On the basis of simulation parameters of electrophoresis by Peakmaster 5.3 software，the effect of buffer solution concentration，pH and separation voltage on separation of six food additives were investigated. The results showed that in the conditions of determine wavelength 214 nm，injecting time 10 s，the optimum electrophoresis conditions were determ ined as 40 mmol/L Na2HPO4-H3PO4，pH 9.0 and separation voltage 12 kV.Under the conditions，the six food additives had a good linear relationship in the range of 20-160 mg/L（R＞0.980 0）.The lim its of detection were 0.23-0.77 mg/L.The adding standard recover rate was 97.3%-103.0% and the relative standard deviation（RSD）was 2.0%-3.8%.The RSD of precision experiments results was 2.0%-3.8%.The method had simple operation，high accuracy and good sensitivity，which could meet the determination requirement of 17 kinds of six food additives in beverages.

capillary electrophoresis；Peakmaster 5.3 software；food additives；beverage；separation and determ ination

O 657．8

0254-5071（2016）05-0187-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．039

2016-02-25

國家自然科學基金（21102030）

代語林（1990-），男，碩士研究生，研究方向為工業及儀器分析。

鄧寧（1976-），女，副研究員，博士，研究方向為毛細管電泳、毛細管電色譜。