水提醇沉法提取苦瓜多糖條件研究

李士杰，肖連冬*

（1.南陽市基礎(chǔ)教育教學(xué)研究室，河南南陽473000；2.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473000）

水提醇沉法提取苦瓜多糖條件研究

李士杰1，肖連冬2*

（1.南陽市基礎(chǔ)教育教學(xué)研究室，河南南陽473000；2.南陽理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽473000）

該文對苦瓜多糖的浸提、醇析條件進(jìn)行研究。考察了料水比、浸提溫度和浸提時間對苦瓜多糖浸出率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)確定了浸提的最佳條件；通過醇析體系中乙醇濃度對苦瓜多糖醇析效果的影響，確定了適宜乙醇沉淀體積分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，苦瓜多糖最佳浸提條件是料液比1∶30（g∶m L），浸提溫度100℃，浸提時間0.5 h，在此條件下，多糖浸出率達(dá)3.58%；乙醇體積分?jǐn)?shù)80%時醇沉多糖效果最好，水提醇沉后粗多糖提取率達(dá)3.12%。

苦瓜；多糖；提取；醇析

多糖（polysaccharide）又稱多聚糖，是由單糖縮合成的天然大分子聚合物，廣泛分布于自然界中，是一類重要的活性物質(zhì)。目前已有報道的天然多糖化合物約有300多種，廣泛存在于植物、動物和微生物組織中［1］。多糖與人類生活緊密相關(guān)，對維持生命活動起著至關(guān)重要的作用，和蛋白質(zhì)、核酸、脂類構(gòu)成了最基本的4類生命物質(zhì)［2］。大量藥理和臨床試驗(yàn)證明，多糖作為一種幾乎無毒副作用的天然提取物，在治療腫瘤、免疫力低下、高血糖、衰老、病毒性疾病等方面療效獨(dú)特［3-4］。苦瓜又名涼瓜，是傳統(tǒng)的藥食同源瓜果。苦瓜多糖是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的雜多糖，具有降血糖、抗氧化、抗菌、抗輻射、降血脂和免疫調(diào)節(jié)活性，能夠增強(qiáng)機(jī)體巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等免疫系統(tǒng)的功能及激活或促進(jìn)抗體、補(bǔ)體的生成和干擾素的誘生［5-8］，具有很好的發(fā)展前景。因此，探索苦瓜多糖最佳提取條件在開發(fā)功能食品、營養(yǎng)保健食品及醫(yī)藥臨床治療方面意義重大。

目前苦瓜多糖的提取方法主要包括熱水浸提法、稀酸提取法、稀堿提取法、微波提取法、超聲波提取法、雙酶水解法等［8］。熱水浸提方法最簡單，易于操作，不需特殊設(shè)備，利用熱水溶出多糖；稀酸提取法采用酸溶液對苦瓜多糖提取，得率較低，產(chǎn)生酸廢水；稀堿提取法是采用NaOH水溶液提取苦瓜多糖，易降解，且堿廢水需處理；微波提取法能加速組織裂解和細(xì)胞破裂，促進(jìn)多糖快速溶出，但投入大；超聲波提取法利用超聲波的空化效應(yīng)及機(jī)械剪切作用來破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，強(qiáng)化傳質(zhì)，以達(dá)到提高有效成分收率的目的，但投入較大；雙酶法采用纖維素酶-果膠酶協(xié)作用，使苦瓜細(xì)胞壁分解，促進(jìn)苦瓜多糖的溶出，條件溫和，減少能耗，但酶解時間長，成本較高［8-9］。楊稅等［10］以新鮮苦瓜為原料，在相同環(huán)境下，以苦瓜多糖提取率為考察指標(biāo)，比較常規(guī)水浸法、超聲波提取法、雙酶水解法、微波萃取法等不同提取方法，結(jié)果顯示熱水浸提法最好，操作簡單、提取條件溫和、綠色環(huán)保。本試驗(yàn)采用水提醇析法，研究熱水浸提、醇析獲取水溶性苦瓜多糖的工藝條件，確定各項(xiàng)主要技術(shù)參數(shù)，以期為苦瓜多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

苦瓜：市售；蒽酮、丙酮、硫酸、無水乙醇、無水乙醚、D-葡萄糖、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉等均為市售分析純。

1.2儀器與設(shè)備

FW-100高速萬能粉碎機(jī)、HH·S11-4電熱恒溫水浴鍋：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、W 201D恒溫水浴鍋：上海申順生物科技有限公司；TDL-40B飛鴿牌系列離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠制造；721分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BS110S電子天平：德國Sartorius公司；DH6-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精密試驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHB-3循環(huán)多用途真空泵：鄭州杜甫儀器廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1苦瓜多糖制取工藝

鮮苦瓜去瓤、切片、干燥、粉碎過60目篩得苦瓜粉，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇回流，除去苦瓜中的單糖、低聚糖、甙類等水溶性雜質(zhì)［11］。經(jīng)過回流處理風(fēng)干后的苦瓜粉，按照一定的料液比，采用熱水浸提苦瓜多糖，抽濾得浸提液，于60℃條件下用真空濃縮至原體積的20%，醇析沉淀多糖，離心分離出沉淀物，分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥后得苦瓜粗多糖。

1.3.2多糖的測定

（1）總糖的測定方法

采用硫酸-蒽酮比色法［12］。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取恒質(zhì)量的D-葡萄糖20 mg，加蒸餾水溶解后定容到100 m L，制成200 μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖。準(zhǔn)確稱取1 g蒽酮以乙酸乙酯定容至50 m L。取6支試管，分別加入200 μg/m L的葡萄糖溶液0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L，然后分別加入蒸餾水2.0 m L、1.8 m L、1.6 m L、1.4 m L、1.2 m L、1.0 m L配制一系列不同的葡萄糖溶液，并在每支試管中立即加入蒽酮試劑0.5 m L，再用刻度吸管加入濃硫酸5 m L，搖勻，反應(yīng)10 min，在波長620 nm條件下比色。以葡萄糖含量（x）作橫坐標(biāo)，以吸光度值（y）作縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）還原糖的測定方法

采用斐林試劑比色法［12］。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取80℃條件下烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖0.100 0 g，加蒸餾水溶解，并定容至100 m L，配成0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7支試管，分別在各管中加入4 m L斐林試劑，然后分別加入0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、1 m L、2 m L、3 m L、4 m L、5 m L、6 m L，并分別加蒸餾水補(bǔ)足至10 m L，每管含葡萄糖各為0、1 mg、2 mg、3 mg、4 mg、5 mg、6 mg，混合搖勻后加塞，于沸水浴中加熱15 m in。取出后在流水中冷卻，再經(jīng)1 500 r/m in離心5 min。取上清液在波長590 nm條件下比色，以葡萄糖含量（x）作橫坐標(biāo)，以吸光度值（y）作縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3多糖含量和多糖提取率的計(jì)算

先采用硫酸-蒽酮比色法測出苦瓜中總糖的含量，再用斐林試劑比色法測出還原糖的含量，總糖減去還原糖即為苦瓜中多糖的含量［13］。

1.3.4苦瓜多糖浸提條件的確定

準(zhǔn)確稱取一定量經(jīng)乙醇回流風(fēng)干后的苦瓜粉，用蒸餾水進(jìn)行苦瓜多糖的提取，過濾得浸提液，測定其吸光度值A(chǔ)620nm，計(jì)算出多糖浸出率［14-16］。

（1）單因素試驗(yàn)

在其他條件相同時，分別研究不同的料水比（1∶15、1∶20、1∶25、13∶30、1∶35、1∶40（g∶m L））、浸提溫度（60℃、70℃、80℃、90℃、100℃）和浸提時間（0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h）對苦瓜多糖浸出率的影響。

（2）苦瓜多糖浸提的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（A）、浸提溫度（B）和浸提時間（C）3個因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，以苦瓜多糖浸出率為評價指標(biāo)，確定苦瓜多糖提取的最優(yōu)工藝條件。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見表1［17］。

表1　苦瓜多糖提取條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Fac tors and levels of orthogonal experim ents for extrac tion conditions optim ization o f balsam pear polysaccharide

1.3.5苦瓜多糖醇沉條件的確定［18］

分別稱取經(jīng)乙醇回流干燥后的苦瓜粉4份，每份均為1.00 g，按1∶25（g∶m L）的料水比加入蒸餾水，在溫度為100℃的水浴鍋上浸提0.5 h，收集濾液，并濃縮至原體積的20%，分別加入乙醇，使體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為60%、70%、80%、90%，搖勻，室溫下醇析12 h，沉淀洗滌干燥后稱質(zhì)量，測定其多糖含量，計(jì)算出粗多糖提取率。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用硫酸-蒽酮比色法測定不同含量的葡萄糖在波長620 nm處的吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（蒽酮比色法）Fig．1 Standard curve of glucose（anthrone colorimetry）

由圖1可知，在葡萄糖含量0～200 μg范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.003 3x+0.013 3，擬合系數(shù)R2=0.997 9。結(jié)果表明，葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

采用斐林試劑比色法測定不同含量的葡萄糖在波長590 nm處的吸光度值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，繪制出葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（斐林試劑比色法）Fig．2 Standard curve of glucose（F ehling reagent colorim etry）

由圖2可知，在葡萄糖含量0～6 mg范圍內(nèi)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.041 0x+0.000 4，擬合系數(shù)R2=0.998 3。結(jié)果表明，葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.2苦瓜多糖浸提條件的優(yōu)化

2.2.1苦瓜多糖浸提的單因素試驗(yàn)

（1）料液比對多糖提取效果的影響

分別選取料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40（g∶m L），在溫度為90℃條件下浸提1 h，考察不同料液比對多糖浸出率的影響。其結(jié)果見圖3。

圖3　料液比對苦瓜多糖浸出率的影響Fig．3 Effect of material-water ratio on extraction rate of ba lsam pear polysaccharides

由圖3可知，料液比對浸出率影響很大。料液比在1∶15～1∶25（g∶m L）時，隨著料液比升高，多糖浸提充分，浸提液中多糖的含量迅速升高，當(dāng)料液為1∶30（g∶m L）時，多糖浸出率達(dá)到最大值3.01%，繼續(xù)再加大料液比，多糖浸出率略有降低，這可能是因?yàn)槎嗵呛亢艿蜁r對溫度的抵抗能力降低而致使其結(jié)構(gòu)有所破壞。結(jié)果表明。苦瓜多糖在料液比1∶30（g∶m L）的條件下已基本溶出，此時多糖浸出率較高。故料液比選擇1∶30（g∶m L）較為適宜。

（2）浸提溫度對多糖提取效果的影響

選取料液比1∶25（g∶m L），分別在溫度60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下浸提1 h，過濾，分別測定其吸光度值，考察不同料液比對多糖浸出率的影響。其結(jié)果見圖4。

圖4　浸提溫度對苦瓜多糖浸出率的影響Fig．4 Effect of extraction tem perature on extraction rate of balsam pear polysaccharides

由圖4可知，浸提溫度為60～90℃時，浸提液中多糖的含量隨著溫度的升高而升高，浸提溫度＞90℃后，多糖浸出率升高變緩，當(dāng)溫度升至100℃時，多糖浸出率達(dá)到最大值3.08%。較高的溫度易使細(xì)胞壁膨脹破裂，多糖溶解充分，浸出較完全，多糖的浸出率就高。因此，最佳浸提溫度為100℃。

（3）浸提時間對多糖提取效果的影響

稱取1.000 0 g預(yù)處理苦瓜粉，在料液比1∶25（g∶m L）、浸提溫度90℃條件下，分別浸提0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h和2.5 h，過濾，分別測定其吸光度值，計(jì)算多糖浸出率。不同浸提時間對多糖浸出率的影響結(jié)果見圖5。

圖5　浸提時間對苦瓜多糖浸出率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction rate of balsam pear polysaccharides

由圖5可知，浸提時間在0.5～1.5 h時，隨浸提時間的延長，苦瓜多糖浸出率逐漸增大，并在提取時間為1.5 h時，多糖浸出率達(dá)最大3.47%，浸提時間＞1.5 h之后，粗多糖浸出率呈迅速下降趨勢，這可能是由于苦瓜多糖在長時間的高溫影響下，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［19］。因此，最佳浸提時間為1.5 h。

2.2.2苦瓜多糖提取的正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多糖浸出率為考察指標(biāo)，料液比、浸提溫度及浸提時間各因素分別選擇3個水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2　多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experim ents for extraction conditions o f balsam pear polysaccharide optim ization

由表2可知，各因素影響苦瓜多糖浸出率的主次關(guān)系順序：浸提溫度（B）＞料液比（A）＞浸提時間（C），最佳工藝條件為A2B3C1，即料液比為1∶30（g∶m L），提取溫度100℃，提取時間0.5 h。在此最佳條件下，苦瓜多糖浸出率為3.58%。

由表3可知，在影響提取苦瓜多糖浸出率的3個因素中，浸提溫度影響極顯著（P＜0.01），料液比、浸提時間對多糖的浸出率影響不顯著（P＞0.05）。

表3　正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experim ents resu lts

2.3苦瓜多糖醇沉淀?xiàng)l件的確定

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)體系下沉析苦瓜多糖，對最終苦瓜粗多糖提取率影響結(jié)果見表4。其方差分析結(jié)果見表5。

表4　乙醇體積分?jǐn)?shù)對苦瓜粗多糖提取率的影響Table 4 Effect of ethanol concentration on extraction rate of balsam pear polysaccharides %

表5　多糖醇沉試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis of polysaccharides alcohol precipitation experiments results

由表4可知，當(dāng)醇析體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，粗多糖提取率也隨著升高，當(dāng)體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時，苦瓜粗多糖提取率達(dá)最大值3.16%，平均值為3.12%。

由表5可知，F(xiàn)=376＞F0.01，說明不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對多糖提取率有極顯著（P＜0.01）的影響，為了確定各個乙醇體積分?jǐn)?shù)之間的提取率差異是否顯著，需要進(jìn)行多重比較。這里采用最小顯著差數(shù)法（least significant difference，LSD）進(jìn)行檢驗(yàn)。本試驗(yàn)中，各組內(nèi)觀測次數(shù)相同都為3次，而且組內(nèi)方差為0.002 5，故任何兩組的比較可用最小顯著差LSD0.05=0.094及LSD0.01=0.137 0比較，結(jié)果見表6。

由表6可知，各個乙醇體積分?jǐn)?shù)之間苦瓜粗多糖提取率差異都極顯著（P＜0.01），因此，本試驗(yàn)所選乙醇沉淀最佳條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，粗多糖平均提取率為3.12%。

表6　不同乙醇體積分?jǐn)?shù)多糖提取率差異顯著性比較Table 6 Com parison of significance difference of extrac tion rate by different ethanol concentration

3　結(jié)論

苦瓜多糖為一種具有多種生理活性的物質(zhì)，研究其提取、醇析的條件提高提取率具有重要價值。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，對水浸提苦瓜多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到的最佳提取工藝條件為料液比1∶30（g∶m L），浸提溫度100℃，浸提時間0.5 h，在此條件下，苦瓜多糖浸提率為3.58%；通過研究苦瓜多糖醇析條件得知，將原浸出液濃縮至原體積的20%，在室溫條件下用乙醇醇沉苦瓜多糖12 h，醇沉的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，此時苦瓜多糖提取率最高，達(dá)3.12%。試驗(yàn)利用高溫短時提取苦瓜多糖具有浸出率高，節(jié)約時間，操作簡便，提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)苦瓜多糖提供理論依據(jù)。

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Extraction conditions of balsam pear polysaccharides by water-extraction and alcohol-precipitation method

LI Shijie1，XIAO Liandong2*
（1.Nanyang Basic Education Teaching and Research Section，Nanyang 473000，China；2.College of Biology and Chem ical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473000，China）

The process parameters for balsam pear polysaccharide extraction and alcohol precipitation were researched.The effects of material-water ratio，extraction tem perature and time on extraction rate of balsam pear polysaccharides were investigated.On the basis of single factor experiments，the optimum extraction conditions were determ ined by orthogonal experiments.Through the effect of ethanol concentration on the ethanol precipitation of balsam pear polysaccharides in ethanol precipitation system，the optimum ethanol precipitation concentration was determ ined.Results indicated that the optimum extraction conditions of balsam pear polysaccharides were as follows：material-water ratio 1∶30（g∶m l），extraction temperature 100℃and time 0.5 h.Under the conditions，the extraction rate of polysaccharide was up to 3.58%.W hen the ethanol concentration was 80%，the alcohol precipitation effect of polysaccharide was the optimal.The extraction rate of polysaccharide extracted by alcohol-precipitation was up to 3.12% by water extraction.

balsam pear；polysaccharide；extraction；alcohol precipitation

R286

0254-5071（2016）05-0166-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．035

2016-03-15

南陽市科技局計(jì)劃項(xiàng)目（No.2010GG024）

李士杰（1965-），男，高級教師，本科，主要從事生物學(xué)教學(xué)研究工作。

肖連冬（1964-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。