響應面法優化淮山中總黃酮提取工藝的研究

許靜雅，蘇小軍，2，李清明，李文佳，吳　倩，郭時印*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.湖南農業大學湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南長沙410128）

響應面法優化淮山中總黃酮提取工藝的研究

許靜雅1，蘇小軍1，2，李清明1，李文佳1，吳倩1，郭時印1*

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.湖南農業大學湖南省作物種質創新與資源利用重點實驗室，湖南長沙410128）

該研究結合有機溶劑浸提法與超聲波提取技術，在單因素試驗基礎上，采用響應面法優化淮山中總黃酮的提取工藝。結果表明，總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數60%，輔助浸提時間64 min，液料比11∶1（m L∶g）。在此最佳工藝條件下，淮山中總黃酮提取率為1.87 mg/g，比單純使用超聲波提取淮山中總黃酮的提取率（1.23 mg/g）提高了50%左右。

淮山；黃酮類化合物；響應面法；提取

淮山（Dioscoreaopposita）廣泛存在于我國大部分地區，資源豐富，《本草綱目》中記載山藥能“益腎氣、健脾胃、止瀉痢、化癱涎、潤毛皮”。關于淮山中生物活性成分的研究報道主要集中在多糖、薯蕷皂苷、尿囊素等［1］，研究內容包括提取［2-4］、分離純化［5-6］、活性作用［7-9］等。黃酮類化合物是在植物生長過程中經過長期自然選擇產生的一類次級代謝產物［10］，它具有高度的化學反應性，因此具有重要的藥理作用，包括抗癌、抗菌、抗糖尿病及并發癥、抗炎癥、抗氧化等功效［11-13］。

植物中黃酮類化合物的提取方法主要有傳統提取技術（如水提法、有機溶劑浸提法等）以及新型提取技術（如酶解法、超聲波提取法、超臨界萃取法等）［14］。傳統的提取方法（如水提法等）通過長時間的提取確實可以有效提取黃酮類化合物，但提取時間較長；新型提取技術（如超聲波提取法）明顯縮短了提取時間，卻有可能出現提取率相對較低、提取不完全的現象。若將傳統提取技術與新型提取技術相結合，既可縮短提取工藝所需時間，又可提高黃酮類化合物的提取率。

本研究以湖南所產的淮山為試驗材料，采用有機溶劑浸提與超聲波提取相結合的方法提取淮山中的總黃酮。在單因素試驗的基礎上，利用響應面分析優化［15］淮山中總黃酮有機溶劑浸提輔助超聲波提取的工藝條件。旨在為淮山資源中總黃酮的開發利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

淮山：湖南婁底市售；蘆丁標準品（純度99%）：中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、九水合硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

Sartorius BS224S型電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；WFJ700型可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LD5-2A離心機：北京京立離心機有限公司；DHA-9246A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；FW 135型高速萬能粉碎機：北京市永光明醫療儀器有限公司；KQ5200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1蘆丁標準曲線繪制

蘆丁標準品經105℃烘干至恒質量后，精密稱取20 mg于25 m L容量瓶中，用體積分數80%的乙醇溶液定容，得質量濃度為0.8 mg/m L蘆丁標準溶液。

準確吸取0.5m L、1.0m L、1.5m L、2.0m L、2.5m L、3.0m L標準溶液分別于6個25 m L具塞試管中，用體積分數80%的乙醇溶液補足至10m L，加入質量分數5%NaNO21m L，靜置6min后，加入質量分數10%Al（NO3）31 m L，反應6 min后，加入質量分數10%NaOH 5 m L，最后用體積分數80%的乙醇溶液定容至刻度。在波長510 nm處測定其吸光度值，以吸光度值（A）和對應的質量濃度（C）進行線性回歸，獲得標準曲線回歸方程為A=9.243 8C-0.069 3，R2=0.999。

1.3.2淮山中總黃酮的提取和測定

精密稱取1 g淮山粉末置于50 m L具塞試管中，加入適量體積分數的乙醇，振蕩后浸提一段時間，再置于超聲波清洗器中超聲波提取60min。提取后經3000 r/min離心15min，取上清液待測。根據1.3.1方法測定吸光度值，并根據標準回歸方程計算提取液中總黃酮的質量濃度，樣品中總黃酮提取率計算公式如下：

式中：C為淮山黃酮類化合物提取液質量濃度，mg/m L；V為黃酮類化合物提取液體積，m L；m為淮山粉末質量，g。

1.3.3單因素試驗［16］

選取乙醇體積分數、輔助浸提時間、液料比進行單因素試驗，分別考察乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、輔助浸提時間（0、30 min、60 min、90 min、120 m in）、液料比（6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1（m L∶g））3因素對淮山中總黃酮提取率的影響。

1.3.4響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，運用Design-Expert 8.0.6.1軟件設計3因素5水平響應面試驗。考察乙醇體積分數、輔助浸提時間、液料比3因素間交互作用對淮山中總黃酮提取率的影響，并建立得率和各影響因素間的數學模型，試驗因素與水平見表1。

表1　總黃酮提取工藝響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for total flavono ids extrac tion technology optim ization

2　結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1乙醇體積分數對淮山中總黃酮提取率的影響

不同乙醇體積分數對淮山中總黃酮提取率的影響，結果如圖1所示。由圖1可知，隨著乙醇體積分數升高，總黃酮提取率先升高后下降，當乙醇體積分數為60%時，總黃酮提取率到達峰值，為1.838 mg/g；而乙醇體積分數繼續升高，總黃酮提取率出現較明顯下降，這可能與不同體積分數的乙醇溶液極性不同相關。因此，選擇乙醇體積分數60%為宜。

圖1　乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids

2.1.2輔助浸提時間對淮山中總黃酮提取率的影響

不同輔助浸提時間對淮山中總黃酮提取率的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，總黃酮提取率隨著輔助浸提時間的增加而提升，至60 m in時達到峰值，為1.788 mg/g；隨著輔助浸提時間繼續增加，總黃酮提取率趨于平穩，稍有下降的趨勢，可能是淮山中總黃酮已經提取完全，再繼續增加浸提時間，對總黃酮提取的影響較小。因此，選擇輔助浸提時間60 m in為宜。

2.1.3液料比對淮山中總黃酮提取率的影響

不同液料比對淮山中總黃酮提取量的影響，結果如圖3所示。由圖3可知，隨著液料比增加，總黃酮提取率迅速提升，當液料比為10∶1（m L∶g）時達到峰值，為1.793 mg/g；而液料比繼續增加，總黃酮的提取率趨于平穩，可能是因為此時原料與溶劑已經充分接觸，再增加液料比對總黃酮的提取影響不顯著。因此，選擇液料比10∶1（m L∶g）為宜。

圖3　液料比對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of liqu id-solid ratio on the extraction yield of total flavonoids

2.2響應面優化試驗

2.2.1試驗結果與分析

表2　總黃酮提取工藝響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results o f response surface experiments for total flavonoids extraction technology optim ization

通過淮山中總黃酮提取的單因素考察，選用乙醇體積分數60%，輔助浸提時間1 h，液料比10∶1（m L∶g）為響應面試驗零點，以總黃酮提取率（Y）為考察指標，進行3因素5水平響應面試驗，設計23次試驗，其中析因試驗14次，中心組合試驗重復9次。試驗設計及結果如表2所示。

2.2.2回歸模型分析

響應面數據方差分析結果見表3。利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對表3中的試驗結果進行分析，得到總黃酮提取率的模型二次多項回歸方程：

表3　響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experim ents results

由表3可知，該模型的P值＜0.000 1，表明該模型是極顯著的，失擬項P=0.278 5＞0.05，表明試驗誤差較小，方程的相關系數R2=0.985 0，說明此方程模擬結果具有較高可信度。所選3個因素中輔助浸提時間（X2）與液料比（X3）對淮山中總黃酮提取率的影響顯著，乙醇體積分數（X1）對總黃酮提取率的影響不顯著（P=0.655 4＞0.05）；乙醇體積分數（X1）與輔助浸提時間（X2）、乙醇體積分數（X1）與液料比（X3）的交互作用不顯著，而輔助浸提時間（X2）與液料比（X3）交互作用顯著（P=0.028 0＜0.05）；3個因素的二次項均為極顯著，且由F值與P值可知，3個因素對淮山中總黃酮提取率的影響為：液料比（X3）＞輔助浸提時間（X2）＞乙醇體積分數（X1）。

2.2.3響應面分析

響應面三維圖可直觀反映各因素對淮山中黃酮類化合物提取率的影響及因素間的交互作用大小。等高線形狀反映了各因素交互作用的強弱。等高線趨于圓形時，兩交互作用相對較弱，趨于橢圓形是則較強。為進一步了解3因素間的交互作用，更加直觀地反映各因素對響應值的影響，采用Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制乙醇體積分數、輔助浸提時間和料液比交互作用對總黃酮提取率影響的響應面及等高線，結果見圖4。

由圖4可知，乙醇體積分數（X1）與輔助浸提時間（X2）的交互作用、乙醇體積分數（X1）與液料比（X3）的交互作用的等高線趨近于正圓型，而輔助浸提時間（X2）與液料比（X3）交互作用的等高線則偏橢圓形。在響應面圖中，等高線越趨近于正圓形，交互作用越小；等高線越趨近橢圓形，交互作用越大，所以各因素交互作用大小為：X2X3＞X1X2＞X1X3，與表3分析結果吻合。根據響應面試驗結果對總黃酮提取率進行回歸分析預測，得最優提取工藝條件為乙醇體積分數60.15%，輔助浸提時間63.4 min，液料比10.94∶1（m L∶g），預測最佳工藝條件下，淮山中總黃酮的提取率為1.882 mg/g。

圖4　乙醇體積分數、輔助浸提時間和液料比交互作用對黃酮類化合物提取率影響的響應面及等高線Fig．4 Response surface plots and contour line of effects of interactions between ethanol concentration，auxiliary extraction time and liquid-material ratio on the extraction yield of flavonoids

2.2.4最佳提取工藝條件的預測與驗證

考慮實際操作，將提取工藝條件調整為乙醇體積分數60%，輔助浸提時間64 min，液料比11∶1（m L∶g）。采用調整優化后的提取工藝條件，在此條件下進行3次平行試驗，淮山中總黃酮平均提取率為1.870 mg/g，與預測值1.882 mg/g之間的偏差僅為0.63%，實際值與預測值較接近，表明本響應面優化設計合理可行，該回歸方程能夠反應各因素與總黃酮提取率的影響。

3　結論

本研究采用乙醇輔助浸提與超聲波提取相結合的方法，通過單因素試驗和響應面分析優化設計，確定提取淮山中總黃酮的最佳工藝為乙醇體積分數60%，輔助浸提時間64 min，液料比11∶1（m L∶g），此時淮山中總黃酮的提取率為1.870 mg/g，相對單純使用超聲提取淮山中總黃酮的提取率（1.226 mg/g）提高了50%左右，且整體提取時間適中。傳統提取方法和新型技術相結合對淮山中總黃酮的利用及工業化生產具有一定的指導作用。

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Optim ization of extraction technology of total flavonoids from Chinese yam by response surface methodology

XU Jingya1，SU X iaojun1，2，LI Qingm ing1，LI Wenjia1，WU Qian1，GUO Shiyin1*
（1.College of Food Science and Technology，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China；2.Hunan Provincial Key Laboratory for Crop Germplasm Innovation and U tilization，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China）

Combined w ith organic solvent extraction and ultrasonic extraction technology，on the basis of single factor experiments，the extraction technology of flavonoids in Chinese yam was optim ized by response surface methodology.Results indicated that the optimum extraction conditions were ethanol concentration 60%，auxiliary extraction time 64 min，liquid-solid ratio 11：1（m l：g）.Under the conditions，the extraction yield of total flavonoids in Chinese yam was 1.87 mg/g，which was about 50%higher than that（1.23 mg/g）by ultrasonic extraction.

Chinese yam；flavonoids；response surface methodology；extraction

TS20

0254-5071（2016）05-0115-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．024

2016-03-11

湖南省自然科學基金（2015JJ4028），湖南農業大學大學生創新性實驗計劃項目（XCX14080）

許靜雅（1988-），女，碩士研究生，研究方向為營養與食品衛生。

郭時印（1975-），男，副教授，博士，研究方向為食品營養。