丙酸發(fā)酵過程中四種有機(jī)酸快速、簡便的分析方法

楊海朋，王自強(qiáng)，王云山*，張利平，蘇志國

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002；2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京100190）

丙酸發(fā)酵過程中四種有機(jī)酸快速、簡便的分析方法

楊海朋1，2，王自強(qiáng)2，王云山2*，張利平1，蘇志國2

（1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002；2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點實驗室，北京100190）

產(chǎn)酸丙酸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)丙酸的同時也會伴隨有機(jī)雜酸的產(chǎn)生，通過對4種有機(jī)酸的監(jiān)測以期調(diào)控發(fā)酵條件，從而使丙酸高產(chǎn)。應(yīng)用HPLC的方法分別研究了在不同流動相種類、pH、洗脫條件、流速、柱溫條件下四種有機(jī)酸的分離狀況，建立了快速、簡便測定丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸四種有機(jī)酸的方法。結(jié)果表明，色譜柱條件為COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm），檢測器為紫外檢測器，紫外檢測波長為210 nm，流動相為K2HPO4緩沖液（0.02 mol/L）和乙腈（0～1%梯度洗脫），流速1.0 m L/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL，采用外標(biāo)法定量。在該條件下各物質(zhì)線性回歸方程相關(guān)系數(shù)均＞0.999，加樣回收率均在95%～105%，精密度實驗結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5.0%，表明該方法準(zhǔn)確度高、精密度好，可為丙酸發(fā)酵過程中四種有機(jī)酸的監(jiān)控及發(fā)酵調(diào)控提供數(shù)據(jù)參考。

高效液相色譜；丙酸；發(fā)酵；有機(jī)酸；檢測

丙酸又稱甲基乙酸，是一種常見的天然有機(jī)弱酸，無色透明帶刺激氣味的液體，有吸濕性，具有爆炸危險［1］。對人畜基本無害，被廣泛應(yīng)用于谷物、飼料和食品的防腐保鮮中［2-3］。同時也可用于制取有機(jī)化工原料及中間體α-氯丙酸、2，2-二氯丙酸和α-嗅丙酸等［4］。在醫(yī)藥領(lǐng)域，丙酸可作醫(yī)藥中間體［5］。其生產(chǎn)方法主要有兩種：一是化學(xué)合成法，主要以石油為原料經(jīng)過丙醛氧化或乙烯羥基化生產(chǎn)［6］；二是微生物發(fā)酵法，用丙酸桿菌代謝得到丙酸。

在目前廣泛使用的三大防腐劑中，丙酸是公認(rèn)的最經(jīng)濟(jì)實惠且安全有效的食用性防腐劑，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丙酸作為綠色安全的生產(chǎn)方法得到了廣泛的關(guān)注，但產(chǎn)酸丙酸桿菌（Propionibacterium acidipropionici）在發(fā)酵生產(chǎn)丙酸時，同時會產(chǎn)生一定乙酸、乳酸、丁二酸等有機(jī)雜酸，不僅降低了糖酸轉(zhuǎn)化率，同時為后期的分離提純產(chǎn)生了很大的影響。發(fā)酵過程中對這4種有機(jī)酸含量的監(jiān)測以期調(diào)控發(fā)酵條件，實現(xiàn)丙酸產(chǎn)量的提高是需要解決的首要問題。

目前丙酸的檢測中一般采用水蒸氣蒸餾提取法，反向液相色譜［7］和氣相色譜法［8-9］，而乳酸、乙酸和丁二酸有報道通過中和滴定法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［10］、生物傳感器法、直接進(jìn)樣色譜法、酯化處理間接進(jìn)樣色譜法、比色法和綜合測定等方法進(jìn)行測定［11］，其中HPLC法具有樣品預(yù)處理簡單、靈敏度高和分析時間短等優(yōu)點［12］。本研究通過應(yīng)用HPLC的方法對4種有機(jī)酸的分離條件進(jìn)行研究，使4種有機(jī)酸通過HPLC方法很好的分離，方便發(fā)酵過程中4種有機(jī)酸的監(jiān)控，為丙酸的發(fā)酵調(diào)控提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

產(chǎn)酸丙酸桿菌（Propionibacterium acidipropionici）WY 320菌株：本實驗室篩選保藏。

酵母浸膏：安琪酵母股份有限公司；玉米漿干粉：河北靈山鶴植物蛋白制造有限公司；葡萄糖、氨水、硫酸銨、丙酸鈉、丁二酸鈉、乙酸鈉、乳酸鈣（色譜純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）：Fisher公司；磷酸氫二鉀（色譜純）：西隴化工股份有限公司。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖35 g/L，玉米漿20 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L，pH控制7.0；

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖60 g/L，玉米漿30 g/L，酵母膏5 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸氫二鉀4 g/L，pH控制在7.0。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀（配置LCsolution色譜工作站，LC-20AT恒流泵，SIL-20A進(jìn)樣器，SPD-20A紫外檢測器）：日本島津公司；COSMOSIL 5C18-PAQ色譜柱（4.6 mm× 250 mm）：北京吉瑞森科技有限責(zé)任公司；7L全自動攪拌式發(fā)酵罐：上海百侖生物科技有限公司，PL 203電子天平、Delta 320 pH計：瑞士梅特勒托利多公司；SHB-111循環(huán)水式多用真空泵：上海振捷實驗設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精確稱取4種有機(jī)酸1 g，用超純水分別定容至100 m L，配制成質(zhì)量濃度為10 g/L的母液，備用。

1.3.2樣品制備

將活化后由甘油管保存的2 m L產(chǎn)酸丙酸桿菌菌液接種到50 m L種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h；后轉(zhuǎn)接至500 m L種子培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48 h；按10%的接種量接種到7 L發(fā)酵罐中，30℃、50 r/min發(fā)酵50 h，10 000 r/min離心5 min，取上清放入4℃冰箱冷藏，備用。

1.3.3檢測波長的確定

本實驗采用色譜柱COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm× 250 mm），紫外檢測器，在檢測溫度40℃，進(jìn)樣量10 μL等條件下研究樣品的最佳分離條件。

因丙酸、乙酸、乳酸和丁二酸在波長210 nm處均有較為明顯的吸收［13-14］，故檢測波長選擇210 nm。

1.3.4流動相種類的確定

通過查閱柱子及待分離物質(zhì)的性質(zhì)來確定流動相種類。

1.3.5色譜條件的確定

分別在pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0時，流動相的乙腈濃度在0～1%、1%～2%、0～2%，柱溫分別在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，流速分別在0.4m L/min、0.6m L/min、 0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4m L/min、1.6 m L/min時進(jìn)行4種有機(jī)酸分離情況的研究。

1.3.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L，按照已確定的最優(yōu)條件方法，應(yīng)用HPLC的同時聯(lián)用紫外檢測器，使4種經(jīng)過C18柱子分離的物質(zhì)分別經(jīng)過紫外檢測器進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.3.7重復(fù)性實驗

取發(fā)酵50 h離心后的上清液，4%稀H3PO4稀釋50倍，0.22 μm濾膜過濾，分別配制6次相同上清液進(jìn)行測定，采用優(yōu)化后的HPLC條件進(jìn)行重復(fù)性實驗。

1.3.8精密度實驗

取發(fā)酵50 h離心后的上清液，4%稀H3PO4稀釋50倍，0.22 μm濾膜過濾，采用優(yōu)化后的HPLC條件，對一個樣品重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行精密度實驗。

1.3.9加樣回收率實驗

取已知含量的樣品，準(zhǔn)確加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品。重復(fù)進(jìn)樣6次，采用已優(yōu)化好的HPLC條件測定各物質(zhì)總含量，并計算其加樣回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2　結(jié)果與分析

2.1流動相種類的確定

通過查閱柱子及分離物質(zhì)的性質(zhì)，確定流動相為K2HPO4緩沖液（0.02 mol/L）和乙腈［15］。一方面COSMOSIL 5C18-PAQ色譜柱采用高純度耐酸堿的硅膠為填料，在全水情況下分離情況良好；另一方面發(fā)酵液中4種有機(jī)酸性質(zhì)較為相近，均為親水性較強(qiáng)的有機(jī)酸且許多緩沖溶液在波長210 nm附近有較強(qiáng)的吸收，使得本底值提高，靈敏度降低，有時根本無法測定。磷酸鹽緩沖溶液是最典型、適用的洗脫液，在紫外區(qū)幾乎無吸收，可作為有機(jī)酸測定的流動相，故選擇K2HPO4緩沖液（0.02 mol/L）作為流動相，乙腈為有機(jī)溶劑幫助洗脫；再有考慮到流動相pH對酸的電離和柱子壽命的影響，采用稀H3PO4作為流動相pH的調(diào)節(jié)酸。

2.2流動相pH的確定

在pH3.0，4%乙腈，流速1.0 m L/min，室溫（25℃）條件下考察流動相不同pH值時4種有機(jī)酸的分離情況。丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的酸度系數(shù)（pKa）分別為4.874、3.860、4.757、4.218，因C18柱子分離原理是分子的疏水性，而4種酸在pH≤4.0時以分子狀態(tài)存在，另一方面pH過低會影響柱子使用壽命，故分別取pH在2.0，2.5，3.0，3.5，4.0（用4%稀H3PO4進(jìn)行pH的調(diào)節(jié)）時進(jìn)行研究，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，pH在2.0、2.5、3.0、3.5時乳酸和乙酸分離效果不好，丁二酸和丙酸出峰時間過晚，pH在4.0時4種酸分離效果較好且出峰時間相對較早，保留時間相差較大，故選擇最優(yōu)pH值為4.0。

圖1　不同pH條件下4種有機(jī)酸的分離情況Fig.1 Separation conditions for four organ ic acids in differen t pH

2.3乙腈洗脫濃度的確定

在pH4.0，流速1.0 m L/min，室溫（25℃）條件下考察不同乙腈洗脫濃度時4種有機(jī)酸的分離情況。選擇流動相的乙腈洗脫濃度在0～1%，1%～2%，0～2%進(jìn)行乙腈梯度洗脫的研究，結(jié)果見圖2。

圖2　不同乙腈濃度下4種有機(jī)酸的分離情況Fig.2 Separa tion conditions for four organic acids in different concentrations of acetonitrile

由圖2可知，乙腈濃度在0～1%梯度洗脫時，效果最好，故最優(yōu)乙腈洗脫濃度為0～1%梯度洗脫。

2.4柱溫的確定

圖3　不同柱溫條件下4種有機(jī)酸的分離情況Fig.3 Separation conditions for four organic acids in different colum n tem perature

在pH 4.0，乙腈（0～1%梯度洗脫），流速1.0 m L/min條件下考察不同柱溫時4種有機(jī)酸的分離情況。選擇溫度分別在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃時進(jìn)行四種有機(jī)酸分離情況的研究，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，柱溫對于4種物質(zhì)的分離情況影響不大，分離差異不明顯，在25℃時分離效果較好，故最優(yōu)柱溫為25℃。2.5流速的確定

在pH4.0，乙腈（0～1%梯度洗脫），室溫（25℃）條件下考察不同流速時4種有機(jī)酸的分離情況。分別選取流速為0.4m L/min、0.6m L/min、0.8m L/min、1.0m L/min、1.2m L/min、1.4 m L/min、1.6 m L/min進(jìn)行4種酸分離情況的研究，結(jié)果見圖4。

圖4　不同流速條件下4種有機(jī)酸的分離情況Fig.4 Separation conditions for four organic acids in different flow rates

由圖4可知，隨著流速的不斷增加，洗脫時間逐漸變短，分離效果逐漸變差。且可以看出在0.4 m L/m in時分離效果最佳，但此條件下整個檢測方法耗時過長，考慮到檢測方法耗時和分離情況的綜合因素，最優(yōu)流速選為1.0 m L/min。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照最優(yōu)色譜條件即流動相為K2HPO4緩沖液（0.02 mol/L），pH4.0，乙腈（0～1%梯度洗脫），流速1.0 m L/m in，室溫（25℃）時進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定，應(yīng)用HPLC的同時聯(lián)用紫外檢測器，使4種經(jīng)過C18柱子分離的物質(zhì)分別經(jīng)過紫外檢測器進(jìn)行測定，其高效液相色譜圖見圖5，4種物質(zhì)的線性回歸方程及相關(guān)指標(biāo)見表1。

圖5　四種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品分離情況Fig.5 Separation conditions of standard substance of four organic acids

表1　四種有機(jī)酸的線性回歸方程、保留時間及線性范圍Table 1 Linear regression equa tion，retention time and linear range of four organic acids

由圖5和表1可知，各種物質(zhì)有很好的分離效果，以組分濃度X對峰面積Y進(jìn)行線性擬合，方程的相關(guān)系數(shù)均＞0.999。

2.7重復(fù)性實驗

取發(fā)酵50 h離心后的發(fā)酵上清液，4%稀H3PO4稀釋50倍，用0.22 μm的濾膜過濾，分別配制6次相同上清液進(jìn)行測定，采用優(yōu)化后的HPLC條件進(jìn)行準(zhǔn)確度實驗，分離情況見圖6。

圖6　發(fā)酵液中四種物質(zhì)分離情況Fig．6 Separation conditions o f four organic acids in fermentation broth

分別計算4種物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果為丙酸2.87%，乙酸2.73%，乳酸2.03%，丁二酸2.42%，4種物質(zhì)的RSD均＜5%，可見此分析方法重復(fù)性良好，可滿足分析要求。

2.8精密度實驗

取發(fā)酵50 h離心后的發(fā)酵上清液，4%稀H3PO4稀釋50倍，用0.22 μm的濾膜過濾，采用優(yōu)化后的HPLC條件進(jìn)行精密度實驗，對一個樣品重復(fù)進(jìn)樣6次，計算4種物質(zhì)檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為丙酸2.47%，乙酸1.68%，乳酸2.38%，丁二酸1.58%，4種物質(zhì)檢測結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5%，可見該方法的精確性良好，可滿足分析要求。

2.9加樣回收率實驗

取已知含量的樣品，準(zhǔn)確加入定量的標(biāo)準(zhǔn)品。重復(fù)進(jìn)樣6次，采用已經(jīng)優(yōu)化好的HPLC條件測定各物質(zhì)總含量，并計算其加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。由表2可知，各物質(zhì)的RSD在2.26%～5.06%，加樣回收率為95%～105%，回收率較好，表明該方法準(zhǔn)確可靠，滿足分析要求。

表2　四種酸加樣回收率實驗結(jié)果Table 2 Results of adding standard recovery rate experiment of four organic acids

3　結(jié)論

通過優(yōu)化流動相組成及配比、pH值、流速和柱溫等條件，建立了一種基于HPLC的快速測定產(chǎn)酸丙酸桿菌發(fā)酵液中丙酸、乳酸、乙酸和丁二酸的方法，具有分析速度快、線性范圍寬、靈敏度高等優(yōu)點，可用于丙酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)丙酸實時監(jiān)控。色譜條件為COSMOSIL 5C18-PAQ色譜柱（4.6 mm×250 mm），紫外檢測器，紫外檢測波長為210 nm，流動相為K2HPO4緩沖液（0.02 mol/L）和乙腈（0～1%梯度洗脫），流速1.0 m L/min，柱溫25℃，檢測器溫度40℃，進(jìn)樣量10 μL，采用外標(biāo)法定量。

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Fast and convenient determ ination method of four organic acids during propionic acid fermentation

YANG Haipeng1，2，WANG Ziqiang2，WANG Yunshan2*，ZHANG Liping1，SU Zhiguo2
（1.College of Life Science，Hebei University，Baoding 071002，China；2.National Key Laboratory of Biochem ical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China）

Propionibacterium not only produces propionic acid during fermentation，but also produces organic acids.In order to obtain propionic acid w ith high production，four organic acids were monitored to regulate fermentation conditions.The separation conditions of propionic acid，lactic acid，acetic acid and succinic acid under different mobile phases，pH，elution conditions，flow rates，column tem peratures were explored by HPLC.Then a fast and convenient method was set up to determ ine the contents of four organic acids.Results showed that the optimal conditions were column COSMOSIL 5C18-PAQ（4.6 mm×250 mm），ultraviolet detector with wavelenth of 210 nm，0.02 mol/L KH2PO4and 0-1%acetonitrile as mobile phase，flow rate 1.0 m l/m in，column temperature 25℃and loading volume 10 μl，and the acids contents were quantified w ith external standard method. Under these conditions，the correlation coefficients R2were all more than 0.999，the average adding recoveries were 95%-105%，RSD of precision tests results were all less than 5.0%.The method was with high accuracy and good precision，and it was suitable for four organic acids contents determ ination in propianic acid fermentation，which provided reference for monitoring and controlling four orangic acids in fermentation.

HPLC；propionic acid；fermentation；organic acid；determ ination

Q815

0254-5071（2016）05-0107-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．022

2016-03-09

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃'973'基金資助項目（2013CB733604）；國家自然科學(xué)基金資助項目（21506227）

楊海朋（1991-），男，碩士研究生，研究方向為生物工程。

王云山（1962-），男，研究員，博士，研究方向為微生物發(fā)酵。