產β-葡萄糖苷酶非釀酒酵母的篩選及酶學特性研究

張　敏，李佳益，史學偉，倪永清*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

產β-葡萄糖苷酶非釀酒酵母的篩選及酶學特性研究

張敏，李佳益，史學偉，倪永清*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

通過對新疆石河子葡萄產區(qū)葡萄中的酵母菌的篩選，采用酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基分離純化菌株，并對分離菌株進行分子生物學鑒定。利用對硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷為底物篩選產β-葡萄糖苷酶酶酵母菌，得到一株高產糖苷酶畢赤酵母屬（Pichia sp.）的非釀酒酵母菌株Y8，并研究該菌株的產β-葡萄糖苷酶酶學特性。結果表明，β-葡萄糖苷酶的最適初始pH值為5.0，最適產酶溫度為30℃，反應時間為15 m in，最適葡萄糖質量濃度為15 g/100 m L。

非釀酒酵母；篩選；β-葡萄糖苷酶；酶學特性

酵母菌株決定了葡萄酒的品質，優(yōu)良的酵母菌株能使葡萄酒的色澤、感官、風味更受顧客的喜愛［1］，采用不同的酵母菌株會使葡萄酒的風味有著很大的差別［2］。篩選出優(yōu)良的酵母菌種是當今葡萄酒行業(yè)研究領域的熱門話題之一。由于我國的葡萄酒產業(yè)起步相對較晚，對于葡萄酒類釀酒酵母的研究也相對較少［3］。

相對于釀酒酵母來說，非釀酒酵母能產生更多種類和數量的胞外酶［4］。膠質酶可以使葡萄汁的提取量增加，使得葡萄酒更加澄清，其中的β-葡萄糖苷酶可以水解糖苷前體物質，使其組成部分的香味物質釋放出來，這樣可以使葡萄酒的香味更加濃郁［5］，另外胞外酶中的蛋白酶會水解葡萄汁中的蛋白質形成溶性多肽和一些氨基酸，能讓葡萄酒的更加清澈且不易變質，酯酶可以水解葡萄酒中的物質釋放香氣成分，而脂肪酶能分解葡萄酒中的脂肪。所有重要的胞外酶在與葡萄汁相互反應，釋放不同的發(fā)酵香氣［6］。而這些酶中非常重要的β-葡萄糖苷酶對于葡萄酒釀造起著至關重要的作用，它可以通過水解作用將葡萄酒中的糖苷鍵分解其非揮發(fā)性風味前體物，產生風味活性物質［7］。相比于葡萄自身含有的葡萄糖苷酶，釀酒酵母中的糖苷酶活性不會因為葡萄糖的存在而降低［8］。所以深入研究葡萄酒的非釀酒酵母產生的酶的活性，對于改善葡萄酒的風味和工藝有著重要的意義［9］。

新疆的地理環(huán)境多樣、生物種類繁多造就了新疆豐富的生物資源，也使得酵母菌的種類繁多，能夠篩選出更多不同種類的釀酒酵母。經過多年的葡萄種植，新疆一些葡萄種植園中孕育多種天然酵母菌株，也產生了許多適合本地生態(tài)環(huán)境和葡萄品種的優(yōu)良天然酵母菌株［10］。本研究的目的是在新疆特色葡萄、中，廣泛采集非釀酒酵母菌，應用于新疆特色釀造發(fā)酵行業(yè)中，以期改善產品質量、提高設備利用率，同時為后期的研究提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1試驗樣品

各種品種葡萄樣品（雷司令，赤霞珠，霞多麗，貴人香）：分別采自新疆石河子143團、152團、新疆石河子中信葡萄酒業(yè)有限公司葡萄試驗園。

1.1.2培養(yǎng)基［11］

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，瓊脂2.0%（固體培養(yǎng)基添加），自然pH，121℃滅菌25 m in。

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，瓊脂2.0%，對-硝基苯基-β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）1.0%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，自然pH，121℃滅菌25 m in。

種子培養(yǎng)基［12］：葡萄糖10.0%，蛋白胨5.0%，K2HPO41.0%，MgSO40.5%，pH 7.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨2.0%，酵母浸粉1.0%，硝酸銨（NH4NO3）0.3%，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.4%，葡萄糖2.0%，蒸餾水配制，自然pH，121℃滅菌25 min。在溫度降到60～70℃左右加入0.1%p-NPG。

1.1.3化學試劑

對-硝基苯基-β-葡萄糖苷酶（p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside，p-NPG）：美國Sigma公司；對硝基苯酚（p-nitrophenyl，p-NP）、葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂、檸檬酸、乙醇、醋酸、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、硝酸銨等試劑均為國產分析純。

1.2儀器與設備

UV-mini-1240紫外分光光度計：日本島津公司；HH-42恒溫水浴箱：常州國華儀器有限公司；SS325高壓蒸汽滅菌鍋：韓國LabTech公司；SPX智能生化培養(yǎng)箱：寧波市江南儀器廠；RC5C高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TC-512PCR擴增儀：英國Techne公司；SW-CJ超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1菌株的分離純化

將成熟果粒破碎、帶皮進行自然發(fā)酵。待發(fā)酵啟動后，分別取發(fā)酵液的前、中、后期各1 m L，梯度稀釋涂布于YPD培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)48 h，挑單菌落于平板上多次劃線純化，獲得純菌株。菌株純化后于斜面上進行保存，存于4℃冰箱備用。

1.3.2酵母菌的形態(tài)特征

根據酵母菌的固體培養(yǎng)菌落特征（菌落質地，菌落顏色，菌落表面特征，菌落邊緣，菌落高度，菌落大小等）和顯微特征（細胞形態(tài)特征，細胞單生、對生或群生，繁殖方式等）對篩選的酵母菌進行分類。

1.3.326S rDNA基因PCR擴增

根據形態(tài)學特征選取生長力較好且具有代表性的菌株，按徐亞男等［13］方法進行脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取及聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增產物測序。

1.3.4高產β-葡萄糖苷酶菌株的篩選

將菌懸液接種于篩選培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)72 h，噴灑碳酸鈉（1 mol/L）進行顯色反應，由于p-NPG經β-葡萄糖苷酶在碳酸鈉的作用下可形成黃色透明圈，透明圈的顏色深淺及大小可以顯示酶活性的高低，因此選取黃色透明圈明顯且黃色圈較大的菌株作高產糖苷酶的實驗菌株。選取較大的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，搖床37℃振蕩培養(yǎng)24 h，5%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床37℃振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.5粗酶液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量為10m L/50m L，121℃滅菌25 m in，無菌接種種子液。30℃條件下搖床勻速（150 r/m in）培養(yǎng)72 h，量取發(fā)酵液，8 000 r/min離心10 min，取上清液，即為β-葡萄糖苷酶粗酶液。

1.3.6粗酶液的酶活測定

取0.05m L粗酶液，將50m L 0.2%p-NPG溶液和0.15m L pH 5.0的醋酸緩沖液均勻混合，30℃水浴預熱10 min，立即加入0.25 mol/L（pH 10.2）碳酸鈉0.25 m L中止反應。室溫放置5 min，在波長400 nm處測定吸光度值。p-NPG酶活定義［14］：每分鐘水解p-NPG產生1nmol p-NP所需的酶蛋白量為一個酶活力單位（U）。酶活力計算公式如下：

式中：U為酶活力，U/m L；0.1為酶液反應體積，m L；t為反應時間；N為原酶液稀釋倍數；C為對硝基苯酚含量，nmol。

1.3.7粗酶性質研究

反應時間對酶活的影響：在反應溫度30℃、緩沖液pH 4.0、葡萄糖質量濃度5 g/100 m L的條件下，分別反應5 m in、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min后測定β-葡萄糖苷酶的酶活，考察不同反應時間對酶活的影響。

初始pH對酶活的影響：用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配制不同pH緩沖液，pH分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，反應溫度30℃、葡萄糖質量濃度5 g/100m L，反應15m in的條件下測定β-葡萄糖苷酶的酶活，考察不同初始pH值對酶活的影響。

反應溫度對酶活的影響：在反應初始pH 4.0、葡萄糖質量濃度5 g/100 m L條件下，分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃反應15 min，測定不同溫度條件下β-葡萄糖苷酶的酶活，考察反應溫度對酶活力的影響。

葡萄糖質量濃度對酶活的影響：在30℃、初始pH 4.0條件下，反應15min，測定葡萄糖質量分數分別為5g/100m L、10 g/100 m L、15 g/100 m L、20 g/100 m L條件下β-葡萄糖苷酶的酶活，考察葡萄糖質量濃度對酶活的影響。

2　結果與分析

2.1酵母菌的分類

本研究對葡萄樣品進行自然發(fā)酵，分離篩選得到78株酵母菌，根據菌落的顏色和形態(tài)將其聚類，共分為18種形態(tài)類型，其中菌株A1、A3、A4、A5、A7、A8是從采自152團葡萄園中的葡萄中分離出來的；菌株N1、N2、N3、N6、N8是從143團的葡萄中分離出來的；菌株Y2、Y5、Y8、Y9、Y11、Y14、Y16是從采自新疆石河子中信葡萄酒業(yè)有限公司葡萄試驗園中的葡萄中分離出來的，各酵母菌株形態(tài)特征見表1。

表1　酵母的形態(tài)特征Table1 Morphological characteristics of yeasts

由表1可知，酵母菌菌落的顏色以奶油色和乳白色居多，菌落形態(tài)主要是球形突起、突面、表面光滑、不透明、奶油狀。

2.2基于26S rDNA基因序列的酵母菌株系統發(fā)育分析

從石河子各個葡萄園采集的葡萄樣品中分離到酵母菌株共78株，通過形態(tài)學特征歸類為18株，選取18株非釀酒酵母菌進行DNA提取及26S rDNA基因PCR擴增，所得序列提交美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI），通過局部序列比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）工具在GenBank數據庫中與已發(fā)表的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列進行同源性比較，構建系統發(fā)育樹，結果見圖1。在基于26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析繪制的系統樹上［15］，相同的種被歸在一個主分枝內，表明它們具有較近的親緣性，而不同的種卻在于不同的亞分枝上，顯示它們在D1/D2區(qū)域序列上具有明顯區(qū)別。由圖1可知，這18株菌都屬于雙核菌亞界，子囊菌酵母亞門。其中菌株A 1、A 7、A 8與接合酵母屬（Zygosaccharomyces spp.）親緣關系較近，基因序列相似性為99%；菌株A3、A4與假絲酵母屬（Candida sp.）親緣關系較近，基因序列相似性為99%；菌株Y8、Y9、N2與畢赤酵母屬（Pichia sp.）親緣關系近，基因序列相似性為99%；菌株N1、 Y2、Y11、Y16與釀酒酵母屬（Saccharomyces cerevisiae sp.）親緣關系較近，基因序列相似性為98%；菌株N8與孢漢遜屬（Hanseniaspora sp.）親緣關系較近，基因序列相似性為98%；菌株N3、N6、Y14與單孢釀酒酵母屬（Kazachstania sp.）親緣關系較近，基因序列相似性為97%；菌株A5、Y5與釀酒酵母屬（Saccharomyces sp.）在26S rDNA基因序列相似性為96%，表明這兩個菌株可能是新種。

圖1　基于26S rDNA序列的19株酵母菌株的系統發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the 19 yeast strains based on 26S rDNA sequence

2.3高產β-葡萄糖苷酶酵母的篩選

在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)18株酵母，分離篩選產β-糖苷酶的菌株。利用p-NPG經β-葡萄糖苷酶作用后生成的對硝基苯酚（p-NP）在碳酸鈉作用下形成黃色透明圈，可極大地提高篩選效率。

通過對酵母產酶的定性分析，初步篩選出高產β-葡萄糖苷酶的酵母。因為透明圈的顏色深淺基本可以顯示酶活性的高低。通過對實驗所用18株酵母進行初步篩選，挑選出高產β-葡萄糖苷酶的酵母，部分菌株篩選結果見圖2。

透明圈直徑越大且顏色越黃表明酶活越高。由圖2可知，根據透明圈的直徑大小以及顏色深淺的比較可得，菌株Y8的透明圈最大且顏色最深，結果表明，菌株Y8產β-葡萄糖苷酶活最高。

圖2　菌株產透明圈比較結果Fig.2 Compa rative results of transparent circle produced by strains

2.4酶活的測定

將篩選出來的黃色透明圈明顯的菌株（A3、Y2、Y9、N8、Y 5、Y 8）按照p-NPG法分別測出β-葡萄糖苷酶的吸光度值，計算出篩選的高產β-葡萄糖苷酶的酵母菌株的酶活，結果如表2所示。由表2可知，菌株酶活力大小順序為A3＜Y2＜Y9＜N8＜Y5＜Y8，其中菌株Y8產β-葡萄糖苷酶活性最好，因此以該菌株作為試驗菌株，研究該菌株產β-葡萄糖苷酶的酶學特性。

表2　β-葡萄糖苷酶酶活測定結果Table 2 Determ ination results of the enzyme activity of β-glycosidase

2.5β-葡萄糖苷酶酶學性質

2.5.1反應時間對酶活的影響

由圖3可知，隨著反應時間的延長，菌株Y 8產β-葡萄糖苷酶與底物的結合程度升高，酶活逐漸升高，當反應時間為15 min時，酶活力達到最高值275.390 U/m L，之后反應時間增加酶活力下降。因此，酶活力最大的反應時間在15 m in時。

圖3　反應時間對β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.3 Effect of reaction time on the enzyme activity of β-glycosidase

2.5.2初始pH對酶活的影響

不同種類的微生物有其最適的生長pH值，同一微生物在其不同的生長階段和不同的生理、生化過程中，也有不同的最適初始pH值要求，這對挑選適宜于發(fā)酵生產中的菌株尤為重要［16］。

圖4　初始pH值對β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.4 Effect of initial pH on the enzyme activity of β-glycosidase

由圖4可知，當初始pH值為5時，菌株Y8產β-葡萄糖苷酶活性最大達到260.277 U/m L。培養(yǎng)基的pH值影響細胞表面基團的解離及其微觀結構，進而影響營養(yǎng)物的吸收及代謝物的分泌，導致微生物生長和代謝發(fā)生變化。因此，當初始pH值為5時，β-葡萄糖苷酶活性最大。

2.5.3反應溫度對酶活的影響

圖5　溫度對β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.5 Effect of tem perature on the enzyme activity o f β-glycosidase

反應溫度是影響微生物成長和代謝的重要因子。由圖5可知，當反應溫度為30℃時，菌株Y8所產β-葡萄糖苷酶酶活性最高，為230.589 U/m L，由此可知，菌株Y 8產β-葡萄糖苷酶最適反應溫度為30℃。

2.5.4葡萄糖質量濃度對酶活的影響

據韓北忠等［17］報道，在Aspergillus oryzae液態(tài)培養(yǎng)產β-葡萄糖苷酶時，葡萄糖會對其產生抑制作用。由圖6可知，對于菌株Y8在葡萄糖質量濃度為0～15 g/100 m L時，酶活性沒有被抑制反而明顯上升，可能是葡萄糖的作用使β-糖苷酶作用位點發(fā)生改變，從而增加酶活性。葡萄糖質量濃度＞15 g/100 m L之后，酶活有所下降。因此，最適萄葡糖質量濃度為15 g/100 m L。

圖6　葡萄糖質量濃度對β-葡萄糖苷酶酶活的影響Fig.6 Effect of glucose content on the enzyme activity o f β-glycosidase

3　結論

試驗通過對葡萄樣品中的酵母菌分離純化、篩選得到78株酵母菌，根據菌落的顏色和形態(tài)將其聚類，共分為18種形態(tài)類型，通過細胞核菌落形態(tài)及26S rDNA D1/D2區(qū)域序列的測定等方法，對所分離的菌株進行較系統的分類鑒定研究，鑒定結果發(fā)現所有菌株屬于6個屬，分別為：假絲酵母屬（Candida sp.）、孢漢遜屬（Hanseniaspora sp.）、釀酒酵母屬（Saccharomyces sp.）、單孢釀酒酵母屬（Kazachstania sp.）畢赤酵母屬（Pichia sp.）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces spp.）。

采用以p-NPG為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基的分離篩選，由于p-NPG經β-葡萄糖苷酶作用后生成的p-NP在碳酸鈉的作用下可形成黃色透明圈，這樣可以很好的分離篩選到產β-葡萄糖苷酶的菌株。采用此方法分離到6株產β-葡萄糖苷酶的菌株，其中有1株高產β-葡萄糖苷酶的酵母菌Y 8，屬于畢赤酵母屬（Pichia sp.），其β-葡萄糖苷酶總酶活性為276.048 U/m L。

高產β-葡萄糖苷酶菌株Y8的最適反應溫度為30℃，這與β-葡萄糖苷酶的最適溫度分布在30～110℃相吻合［18］，最適反應時間是15min，與之前實驗最適時間有一定差異［19-20］，最適葡萄糖質量濃度為15 g/100 m L，最佳初始pH值為4.8。

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Screening of β-glucosidase-producing non-Saccharomyces yeasts w ith and its enzymatic characteristics

ZHANG Min，LI Jiayi，SHI Xuwei，NI Yongqing*
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

Through the screening of yeasts in grapes from Xinjiang Shihezi w ine-producing regions，the strains were isolated and purified by yeast peptone dextrose（YPD）medium，and isolated strains were identified by molecular biology method.Using p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranoside（p-NPG）as substrate，the β-glucosidase-producing yeasts were screened，and one strain of non-Saccharomyces yeast with high glycosidase-production was obtained and identified as Pichia sp.The β-D-glucopyranoside producing characteristics of the strain were researched.The results showed that the optimum initial pH of β-glucosidase was 5.0，the optimum temperature of enzyme production was 30℃，reaction temperature was 15 m in and the optimum content of glucose was 15 g/100 m l.

non-Saccharomyces yeasts；screening；β-glycosidase；enzymatic characteristics

Q 939．9

0254-5071（2016）05-0097-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．020

2016-03-04

兵團工業(yè)科技攻關（2014BA 024）

張敏（1992-），女，碩士研究生，研究方向為食品微生物。

倪永清（1969-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。