核桃青皮活性成分的亞臨界水提取工藝優化及抗氧化活性

丁　蕓，李海姝，劉玉梅*

（新疆大學化學化工學院，新疆烏魯木齊830046）

核桃青皮活性成分的亞臨界水提取工藝優化及抗氧化活性

丁蕓，李海姝，劉玉梅*

（新疆大學化學化工學院，新疆烏魯木齊830046）

該研究采用隨機質心映射法優化了核桃青皮中的單寧酸、總黃酮及蒽醌等活性成分的亞臨界水提取工藝，并考察了其抗氧化活性。結果表明，核桃青皮的最佳提取工藝為萃取溫度194℃，萃取時間55 m in，粉碎粒度80目。在此條件下，核桃青皮中活性成分總提取率為（147.59±0.59）mg/g，其中，總黃酮、單寧酸、蒽醌的提取率分別為（87.43±0.64）mg/g、（56.03±0.06）mg/g、（4.12±0.01）mg/g。在提取物質量濃度為0.6 mg/m L時對DPPH自由基清除率可達99.76%，質量濃度為0.8 mg/m L時對羥基自由基清除率可達97.42%。核桃青皮提取物對DPPH和羥基自由基清除作用的IC50分別為0.186 mg/m L和0.129 mg/mL。研究表明核桃青皮提取物具有較好的抗氧化活性。

核桃青皮；活性成分；隨機質心映射優化；亞臨界水；抗氧化活性

核桃青皮又名青龍衣，是核桃未成熟時的外果皮。已有研究表明，核桃青皮含有豐富的K、Na、Mg、Zn、Ca、Fe、M n等多種礦物質元素［1］和黃酮類［2］、多酚類［3］、醌類［4-5］、多糖［6］、二芳基庚烷類化合物［7-8］，此外還含有甾體、萜類、脂肪酸、維生素等成分［9］。我國每年有大量的核桃青皮廢棄物，除少量藥用或作為燃料使用外基本被廢棄，若能對其加以利用，不僅可以給農民增加收入，還能減少環境污染［10］。

亞臨界水是指在100～374℃范圍內，在外界加壓的條件下仍然保持液態的水，也稱之為高溫水、超加熱水、高壓熱水或熱液態水［11］。亞臨界水與常溫常壓下的水性質差別較大，隨著溫度的提高極性會逐漸下降，具有了很多有機溶劑的性質［12］，可用于提取常壓條件下水不溶的物質。而與有機溶劑相比，亞臨界水更加綠色環保、無污染、廢液處理簡單、得率高，且實驗室中可用水熱反應釜完成，設備簡單、易于操作。目前對提取工藝的優化主要采用的是響應面［13］和正交試驗設計［14］，這兩種試驗設計方法需要先進行單因素試驗，確定各個因素的范圍后再進行正交或響應面試驗確定最佳的工藝條件。而隨機質心映射優化程序（random centroid optim ization，RCO）是一種全局性的優化程序［15］，不需要進行單因素試驗，直接進行優化試驗，更適合于對有多重因素或各因素考察范圍比較寬的試驗條件的優化［16-17］。本試驗采用隨機質心映射優化法研究核桃青皮中的單寧酸、總黃酮及蒽醌等活性成分的亞臨界水提取工藝，考察了萃取溫度、萃取時間和粉碎粒度等3個影響因素，并以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny-2-picrylhydrazy-1，DPPH）和羥基（hydroxyl，OH）自由基清除能力作為評價指標，比較不同質量濃度核桃青皮提取物的抗氧化活性，旨在為農業廢棄物開發利用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新疆本地核桃的青皮，烘干后備用。蘆丁標準品（純度≥98%）：中國藥品生物制品檢定所；單寧酸標準品（純度≥98%）：天津永晟精細化工有限公司；福林-酚（Folin-Ciocalteu）試劑：實驗室配制［18］；1，8-二羥基蒽醌標準品（純度96%～98%）、DPPH、維生素C（Vitamin C，VC）：美國Sigma-Aldrich公司；無水碳酸鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、醋酸鎂、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、磷酸鹽等（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；雙氧水：新疆潔普樂生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

BS210S型電子天平：德國賽多利斯集團；Anke.TGL-16G型離心機：上海安亭科學儀器廠；DHG-9240A電熱恒溫培養箱：北京市永光明醫療儀器廠；UV-5300PC型紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；DHG-9122AA電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；YZ-HPE-25 m L水熱反應釜：上海巖征實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1核桃青皮中活性成分的測定

（1）單寧酸提取率的測定

采用Folin-Ciocalteu法［19］，準確稱20.0 mg單寧酸標準品用蒸餾水定容到100 m L容量瓶，取5 m L定容至25 m L，制成0.04 mg/m L的單寧酸標液。吸取一系列標準溶液置于10m L容量瓶中，以此加入0.5m LFolin-Ciocalteu試劑，1 m L 20%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，在波長760 nm處測定標準溶液的吸光度值，以單寧酸質量濃度（c）和吸光度值（A）繪制標準曲線，得單寧酸標準曲線回歸方程為A=72.935 7c+0.167 4，R2=0.999 5，根據標準曲線回歸方程計算樣品中單寧酸含量。

（2）總黃酮提取率的測定

采用NaNO3-AlCl3絡合-分光光度法［20］，準確稱取10.0 mg蘆丁標準品，加入體積分數的50%乙醇溶解定容至100 m L容量瓶中，配成0.1 mg/m L標液。吸取一系列標準溶液置于10 m L容量瓶中，依次加5%亞硝酸鈉溶液0.3 m L，搖勻，靜置6 m in：再加10%硝酸鋁溶液0.3 m L，搖勻，靜置6 m in，再加1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 m L，以體積分數的30%乙醇溶液定容至10 m L，搖勻，放置15 min。以體積分數30%的乙醇溶液為空白顯色，在波長510 nm處測定標準溶液的吸光度值，以蘆丁質量濃度（c）和吸光度值（A）繪制標準曲線，得蘆丁標準曲線的回歸方程為A=13.274 3c-0.000 8，R2=0.999 4，根據標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮含量。

（3）蒽醌提取率的測定

采用醋酸鎂顯色法［21］，精確稱取10.0 mg 1，8-二羥基蒽醌標準品，用甲醇定容至50 m L，取5.00 m L稀釋至25 m L容量瓶，配成0.04 mg/m L蒽醌標液。吸取一系列標準溶液置于10 m L容量瓶中，分別加0.5%醋酸鎂-甲醇溶液定容至刻度，以0.5%醋酸鎂-甲醇溶液為空白對照，在波長510 nm處測定標準溶液吸光度值，以1，8-二羥基蒽醌質量濃度（c）和吸光度值（A）繪制標準曲線，標準曲線的回歸方程為A=45.592 9c+0.020 9，R2=0.999 6，根據蒽醌標準曲線回歸方程計算樣品中蒽醌含量。

吸取1m L樣品提取液測定吸光度值，分別按上述（1）～（3）的方法測樣品提取液的吸光度值，再通過各自的標準回歸方程計算樣品中單寧酸、總黃酮和蒽醌的提取率，活性成分提取率的計算公式如下：

式中：X為樣品中活性成分提取率，mg/g；c為根據標準曲線計算出的樣品中活性成分的質量濃度，mg/mL；V為總體積，m L；N為稀釋倍數；m為核桃青皮的質量，g。

1.3.2核桃青皮中活性成分的亞臨界水提取

準確稱取0.500 0 g粉碎后的核桃青皮，置于25 m L聚四氟乙烯水熱反應釜中，分別加入15 m L蒸餾水，置于預熱到設定溫度的恒溫箱中進行亞臨界提取，達到提取時間后迅速的將反應釜冷卻到室溫，抽濾，得到提取液，將9 m L提取液定容至50 m L。

1.3.3隨機質心映射優化設計

根據前期的優化預試驗，選擇萃取溫度、萃取時間和粉碎粒度等3個影響因素進行考察，以提取液中總黃酮、單寧酸、蒽醌三種活性物質總提取率為評價指標，根據表1中各因素上下限范圍，輸入隨機質心映射優化程序進行RCO試驗設計，確定最佳工藝條件，待優化因子的上下線范圍見表1。

表1　隨機質心映射待優化因子的上下限范圍Table 1 Upper and lower range of optim ization factors by RCO

1.3.4核桃青皮中活性成分抗氧活性研究

（1）DPPH自由基清除能力的測定

參照文獻記載方法［22］并適當調整。取1.0 m L稀釋的核桃青皮萃取液于試管中，加入3.0 m L DPPH溶液（用甲醇配制成質量濃度為0.04 mg/m L的溶液），充分混勻，暗處靜放1h，在波長517nm處測定其吸光度值。使用1.0 m L甲醇代替樣品作為空白對照組，每組樣品做3個平行。為避免因核桃青皮提取液不同條件下顏色不一致可能給結果帶來誤差，采用1.0 m L樣品溶于3.0 m L甲醇溶液作為對照。

式中：A0為添加樣品時溶液吸光度值；A1為未添加樣品時溶液的吸光度值。

（2）OH自由基清除能力的測定

采用鄰二氮菲-二價鐵氧化法［23］。稱取一定質量的鄰二氮菲用無水乙醇配制成0.075 mol/L鄰二氮菲醇溶液，使用前用重蒸水稀釋100倍。取1.0 m L核桃青皮萃取液于離心管中，分別加入1.0 m L鄰二氮菲（0.75 mmol/L），2.0 m L磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.4，0.2 mmol/L），1.0 m L FeSO4溶液（0.75 mmol/L），搖勻后置于37℃保溫箱中保溫1 h。取出后冷卻，在波長536 nm處測定其吸光度值A1。用1.0 m L 0.1%的H2O2代替樣品管中的1.0 m L樣品，測得的吸光度值記為A2；用2.0 m L重蒸水作空白，測得的吸光度值記為A3。

1.3.5數據處理

實驗數據采用M icrosoft Excel或Origin 8.0專業軟件進行處理，數據結果以平均值（n≥3）±標準偏差來表示。

2　結果與分析

2.1隨機質心優化核桃青皮中活性成分的設計及結果

按照隨機質心設計方案，輸入各因子的范圍后，隨機質心優化軟件設計出相應的試驗方案，試驗設計及結果見表2，對試驗結果采用RCO軟件進行優化條件映射，結果見圖1～圖3。

表2　隨機質心映射試驗設計及結果Table 2 Design and results of RCO experiments

圖1　第一輪優化條件映射圖Fig.1 Pe rception m apping of the first round optim ization condition

圖2　第二輪優化條件映射圖Fig.2 Perception mapping of the second round optim ization condition

圖3　第三輪優化條件映射圖Fig.3 Perception mapping of the third round optim ization condition

圖中箭頭所指為每個因素的最佳映射條件值，由圖1可知，第一輪提取活性物質的最佳工藝條件是：萃取溫度179℃，萃取時間54 min和粉碎粒度20目。圖中箭頭所指方向并不是很明確，映射結果較分散，需要根據第一輪試驗結果確定第二輪試驗中各因子上下限范圍，并輸入到RCO程序中進行第二輪試驗，第二輪優化條件映射圖見圖2。由圖2可知，經過2輪試驗優化后，各試驗因素上下限范圍有所縮小，提取液中總活性物質含量明顯比第一輪有所增加，得到第二輪提取活性物質的最佳工藝條件是：萃取溫度194℃，時間55 min，粉碎粒度80目。為了進一步縮小各試驗因素上下限范圍，故對第三輪試驗進行優化，試驗結果如表2和圖3所示。

由圖3可知，經過三輪試驗條件的優化，最終得到核桃青皮的最佳提取工藝：萃取溫度194℃，萃取時間55m in，粉碎粒度80目，即表2中第二輪中的第14組試驗，由此可以得出第二輪試驗達到最優結果，第三輪試驗是對第二輪的進一步補充驗證，在此條件下，核桃青皮中黃酮、單寧酸和蒽醌的總提取率為（147.87±0.65）mg/g，其中，總黃酮的提取率為（87.70±0.58）mg/g，單寧酸的提取率為（56.05± 0.05）mg/g，蒽醌的提取率為（4.12±0.02）mg/g。以核桃青皮3種活性成分的總提取率為萃取目標，考察的3個因素中，萃取溫度的映射優化圖與其他因素的映射優化圖相比，趨勢線較長、較多，其次是粉粹粒度，最后是萃取時間。趨勢線越多說明該影響因素對提取目標的影響程度越大，所以亞臨界水萃取核桃青皮中活性成分的3個因素的主次關系是萃取溫度＞粉粹粒度＞萃取時間。

2.2最佳提取工藝條件的驗證

經過三輪試驗條件的優化確定核桃青皮中活性成分的最佳提取工藝條件：萃取溫度為194℃，萃取時間為55 min，粉碎粒度為80目，為驗證RCO試驗結果，在最佳提取工藝條件重復萃取3次，結果見表3。由表3可知，總黃酮平均提取率為（87.43±0.64）mg/g，單寧酸平均提取率為（56.03±0.06）mg/g，蒽醌平均提取率為（4.12±0.01）mg/g，活性物質總提取率的平均值為（147.59±0.59）mg/g，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.11%～0.73%，說明試驗測定結果可靠。

表3　驗證試驗結果Fig．3 Results of verification experiments

2.3核桃青皮中活性成分的抗氧化活性研究

DPPH在有機溶劑中以一種穩定的以氮為中心的自由基而存在，若加入具有一定自由基清除能力的物質時，孤對電子就會被配對，吸光度消失或減弱，其清除自由基的大小可通過測定吸光度值減弱的程度來評價。圖4為核桃青皮不同質量濃度提取物對DPPH自由基和羥基自由基的清除率。

圖4　核桃青皮不同質量濃度提取物對DPPH自由基（A）和羥基自由基（B）的清除率Fig．4 Scavenging rate of different extracts content in walnut green husks on DPPH·（A）and·OH（B）

由圖4（A）可知，核桃青皮提取物具有一定的清除DPPH自由基的能力，且隨著提取物質量濃度的升高清除率也在增大。質量濃度為0.6 mg/m L時DPPH自由基清除率高達99.76%，與對照品VC的清除率沒有明顯差異。

在離體實驗體系清除羥基自由基的能力對于抗氧化劑的選擇具有重要意義［24］。以蘆丁作為對照，圖4（B）為核桃青皮不同質量濃度提取物對羥基自由基的清除率。由圖4（B）可知，隨著核桃青皮提取物質量濃度的增加，清除羥基自由基的能力呈明顯的上升趨勢，并與樣品濃度呈正相關關系，當提取物質量濃度為0.8 mg/m L時羥基自由基清除率可達97.42%，與對照品蘆丁的清除率沒有明顯差異。

對自由基清除活性的比較通常以清除體系中50%自由基時所需試樣濃度，即為半數清除率（half maximal inhibitory concentration，IC50），IC50值越低表示樣品抗氧化的能力越強，樣品及對照品清除DPPH自由基和羥基自由基的半數清除率見表4。由表4可知，核桃青皮提取物清除DPPH自由基和羥基自由基的IC50值分別高于相應的對照品VC和蘆丁，可能是由于在亞臨界水的作用下，高溫使得樣品中的黃酮苷或聚合酚類水解成了其苷元而增大了其抗氧化活性，有關樣品中的活性成分的組成還有待進一步的試驗研究。

表4　核桃青皮提取物對DPPH自由基及羥基自由基的IC50Table 4 IC50of walnut green husk extracts on DPPH·and·OH

3　結論

本研究以核桃青皮提取物中的總黃酮、單寧酸和蒽醌的總提取率為考核指標，采用隨機質心優化程序（RCO）優化了亞臨界水作為提取溶劑提取核桃青皮中活性成分的提取工藝，確定最佳提取工藝條件為萃取溫度為194℃，萃取時間為55 m in，粉碎粒度為80目，在此工藝條件下，總黃酮、單寧酸和蒽醌的提取率分別為（87.43±0.64）mg/g，（56.03±0.06）mg/g，（4.12±0.01）mg/g，總提取率是（147.59± 0.59）mg/g。該方法與響應面法和正交設計相比，在影響因素較多時可以在更少的試驗次數內得到最佳的工藝參數。同時對不同質量濃度核桃青皮提取物的抗氧化活性進行了研究，結果表明，不同質量濃度的提取物均具有不同程度的清除羥基自由基和DPPH自由基的能力，且隨樣品濃度的增大清除率提高，在質量濃度為0.6 mg/m L時DPPH自由基清除率高達99.76%，質量濃度為0.8 mg/m L時羥基自由基清除率可達97.42%。兩者與相應對照品VC和蘆丁的清除率無明顯差異。對DPPH和羥基自由基清除作用的IC50分別為0.186 mg/m L和0.129 mg/m L。研究核桃青皮活性成分的提取及抗氧化活性為尋找一種新型天然抗氧化劑提供了理論基礎。

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Optimization of subcritical water extraction technology of the active components in walnut green husks and its antioxidant activity

DING Yun，LI Haishu，LIU Yumei*
（College of Chem istry and Chem ical Engineering，Xinjiang University，Urmuqi 830046，China）

Random centroid optim ization methodology was applied to optim ize the subcritical water extraction technology of active com pounds including tannic acid，flavonoids and anthraquinones in walnut green husks，and its antioxidant activity was investigated.The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：extraction temperature 194℃，extraction time 55 m in and particle size 80 meshes.Under the conditions，the total extraction rate of active compounds was（147.59±0.59）mg/g，in which the extraction rate of flavonoids，tannic acid and anthraquinones were（87.43±0.64）mg/g，（56.03±0.06）mg/g and（4.12±0.01）mg/g，respectively.The scavenging rate of 0.6 mg/m l and 0.8 mg/m l extracts content on DPPH and hydroxy free radical were up to 99.76%and 97.42%，respectively.The IC50of extracts in walnut green husks on DPPH and hydroxyl free radical were 0.186 mg/m l and 0.129 mg/m l，respectively.The study showed that the extracts in walnut green husks had good antioxidant activity.

walnut green husks；active compounds；random centroid optimization；subcritical water；antioxidant activity

TS207．3

0254-5071（2016）05-0075-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．016

2016-02-26

國家自然科學基金資助項目（31360403）

丁蕓（1989-），女，碩士研究生，研究方向為天然產物研究。

劉玉梅（1965-），女，教授，博士，研究方向為天然產物功能因子與分析檢測。