大青葉對酒曲發酵影響的研究

谷雪峰，何松貴，劉幼強，吳振強*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510062；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東佛山528203）

大青葉對酒曲發酵影響的研究

谷雪峰1，何松貴2，劉幼強2，吳振強1*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州510062；2.廣東省九江酒廠有限公司，廣東佛山528203）

該研究以大青葉作為輔料，探討添加大青葉對酒曲發酵的影響。結果表明，添加大青葉使培養基質密度降低、基質疏松，有利于發酵過程的通氣和傳熱，發酵后酸度下降。添加大青葉促進酒曲中霉菌的生長，但抑制細菌和酵母生長，并導致生物活性發生變化，影響效果與大青葉的添加量成正比，當添加量為9%時，糖化酶酶活提高4.24倍，液化酶活、發酵力、酯化力等分別下降30%、90%和80%。同時，添加大青葉使酒曲成品的揮發性成分明顯增多，酯類物質從4種增加至8種，還增加了苯甲醇和多種高級脂肪酸、烷烴、烯烴、酰胺、醇等物質，這些新增物質將會對酒曲風味產生較大影響。

酒曲發酵；大青葉；微生物；發酵力；酯化力

酒曲作為酒釀造過程中的糖化劑、發酵劑和生香劑，其質量的好壞對酒的風味、產率和品質具有極大的影響。傳統酒曲制作多添加中草藥作為輔料（如桑葉、野蓼等［1］），少的添加1種，多的甚至上百種［2-3］。添加方法有破碎后直接添加或熱水浸煮后取浸提液添加。添加的中草藥為酒曲提供植物中的微生物、蛋白質、芳香成分及有毒（抑菌）成分，但對于添加中草藥在酒曲制作過程中的作用機理少見報道。

大青葉是我國是傳統的清熱解毒中草藥，具有抗病毒、抗內毒素和抑菌活性［4］，臨床主要用于流行性感冒、急性傳染性肝炎、痢疾、急性腸胃炎、發斑發疹等疾病［5］。以往對大青葉的研究主要在醫藥和化學成分上，還沒有應用于酒曲的研究發表。大青葉主要含有生物堿、有機酸、苷類、甾醇等幾大類化合物［6-7］，其揮發油成分主要有棕櫚酸、植酮、苯甲醇以及正二十九烷等烷烴類物質［8-9］。

本研究以某酒廠酒曲中的一種添加植物——大青葉作為研究對象，探討添加中草藥對酒曲發酵過程酒曲理化參數及微生物活性的影響，為酒曲添加中草藥輔料的生產工藝提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

大青葉、餅丸（含釀酒酵母、產酯酵母、米根霉、毛霉、華根霉、乳酸菌、醋酸菌等微生物，常溫保藏）：廣東省九江酒廠有限公司；大米、黃豆等：市售；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（potato dextrose agar，PDA）、肉湯培養基、麥芽汁瓊脂培養基、可溶性淀粉、葡萄糖、磷酸二氫銨、磷酸二氫鉀、硫酸鈣、硫酸鎂等（化學純）：國藥集團化學試劑有限公司；石油醚（色譜純）、乙醇（分析純）、己酸乙酯（分析純）、乙酸正戊酯（分析純）：上海泰坦科技股份有限公司。

1.2儀器與設備

7890A-5975C氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）聯用分析儀：美國安捷倫公司；GC-2014C氣相色譜分析儀：日本島津公司ZDJ-4A自動電位滴定儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；LRH-150B生化培養箱：韶關泰宏醫療器械有限公司；UV-2802SH紫外分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；5804R冷凍離心機：德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1酒曲培養基制備

參考酒廠酒曲制作工藝，以大米和黃豆為主料，兩者質量比為8∶2，分別按照1∶1加水、蒸煮30 m in、冷卻至35℃左右后混合，同時加入大青葉（粉碎度為1 cm左右）0、4.5%、9%和餅丸（1.5%），于恒溫恒濕培養箱中（35℃、相對濕度85%）培養6 d。發酵過程中需定時噴灑霧狀水以保持酒曲含水量。每隔2 d取樣分析。

1.3.2酒曲揮發性成分提取

將酒曲置于索氏提取管中。量取150 m L石油醚溶劑于250 m L圓底燒瓶內，置于85℃的恒溫水浴鍋中6 h，取樣，20 000 r/min離心15s，上清液（揮發油）置于樣瓶中，待測。

1.3.3測定方法

酒曲發酵樣品的糖化酶酶活、液化酶酶活、酯化力、含水量、酸度、密度的測定依照參考文獻［10］。

發酵力測定采用排飽和碳酸鈉溶液收集CO2的方法。酒曲微生物測定：采用稀釋平板計數法［11］。

揮發性成分（揮發油）分析方法：揮發油溶解于適量的石油醚，采用GC-MS進行分析。色譜條件：HP-5MS彈性石英毛細柱管（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：50℃保留3 m in，4℃/m in升溫至230℃后，保持30 m in；進樣量為1 μL；進樣口溫度為250℃；載氣為氦氣，流速2 m L/min。質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃；電子倍增器電壓1 858.8 V；掃描質量范圍35～350 m/z。在HP-5MS柱上使用一系列同源性C8-C25正烷烴對所有揮發成分進行標定分析，并通過美國國家標準與技術研究院（national institute of standards and technology，NIST）數據庫進一步確認。各組分相關濃度通過峰面積歸一化法計算求出各化合物的峰面積相對含量。

2　結果與分析

2.1添加大青葉對酒曲發酵過程理化指標的影響

不同添加量的大青葉對酒曲理化指標的影響如圖1所示。

圖1　大青葉添加量對發酵過程中密度（a）、含水量（b）、酸度（c）變化的影響Fig．1 Effect of Folium isatidis addition on density（a），moisture content（b）and total titratable acidity（c）change during ferm entation

由圖1a可以看出，酒曲密度隨著大青葉添加量提高而下降，原因可能是添加大青葉使酒曲基質疏松，添加量越大越疏松，導致密度越小，并隨著發酵推進不斷下降，密度下降速率也隨添加量增加而增大，發酵6 d后添加9%大青葉的樣品密度從1.0 g/cm3降至0.63 g/cm3，降幅為37%；而不添加大青葉的樣品密度從1.18 g/cm3降至1.10 g/cm3，降幅為10%。這主要是與水分蒸發速率相關。由圖1b可以看出，開始時3個樣品含水量均＞55%，但添加大青葉的樣品略低于沒有添加的樣品，是因為滅菌過程前者水分損失大于后者所致；隨著發酵的進行，3個樣品的含水量均有所下降，下降速率隨大青葉添加量增加而增大，添加9%大青葉的樣品含水量降低了25%（4 d），而不加大青葉的樣品含水量下降了14%，說明大青葉添加量越大，酒曲基質越疏松，越容易造成水分的損失。含水量和密度的差異將對培養基質的培養環境造成影響，一般含水量低、密度小的基質結構相對疏松，有利于酒曲氣流擴散，提高傳質傳熱效率［12］，對不同微生物種類的生長和代謝造成不同的影響。由圖1c可以看出，酸度隨大青葉添加量增加而降低，發酵第2天時3個樣品酸度達到最大值，分別為1.38 mmol/10 g（9%大青葉），2.13 mmol/10 g（4.5%大青葉）和2.95 mm ol/10 g（不加大青葉），添加9%大青葉樣品的酸度只有不加大青葉樣品的47%，因為酸度主要由產酸細菌主導，含水量越高（大青葉添加量越小），細菌生長越好，產酸量越大，酸度就越高，反之大青葉添加量越大，含水量越低，產酸量就越小，酸度就越低。同時，酸度的變化對酒曲微生物生長會產生反饋影響，并在酯化反應生成風味物質過程中產生一定的作用［13］。由此可知，添加大青葉培養后酒曲密度、含水量和酸度均有所下降。

2.2添加大青葉對酒曲微生物生長的影響

酒曲發酵是混菌發酵，其微生物有霉菌、酵母和細菌等三大類［14-16］。三類微生物的比例及數量是酒曲質量的重要參數。不同添加量的大青葉對酒曲微生物指標的影響如圖2所示。

圖2　大青葉添加量對發酵過程中細菌（a）、酵母（b）、霉菌（c）數量變化的影響Fig．2 Effect of Folium isatidis addition on bacterium（a），yeast（b）and mold（c）count change during fermentation

由圖2可知，不加葉、添加4.5%和9%大青葉樣品的細菌總數最大值出現在第6天，分別為1.25×108CFU/g、0.79×108CFU/g和0.55×108CFU/g；酵母細胞數最大值出現在第4天，分別為4.95×107CFU/g、0.76×107CFU/g和0.67×107CFU/g，之后少有下降；霉菌細胞數最大值也出現在第6天，分別為0.13×106CFU/g、0.25×106CFU/g和3.54×106CFU/g，可見，添加大青葉對細菌、酵母、霉菌的生長產生不同的影響，其中對細菌和酵母產生抑制（尤其是對酵母菌的抑制率較大），而對霉菌生長起到促進作用。添加9%大青葉條件下細菌抑制率分別達到56%，酵母抑制率達到86.5%，而霉菌生長率達到對照組和3.62倍。原因之一可能是大青葉的消炎殺菌成分對細菌和酵母有較大作用，而對霉菌的作用不大；另一個原因則是細菌和酵母對水活度的要求較高，而霉菌對水活度的要求較低，當添加大青葉后使發酵基質水分下降，使細菌和酵母的生長受到抑制，同時降低了霉菌生長的營養競爭，使霉菌的生長率大幅增加。根據大青葉添加量不同對3種微生物的抑制或促進影響程度存在較大差異的特點，可以通過改變大青葉添加量實現對霉菌、酵母及細菌比例的調控，從而實現調節酒曲發酵特性的目的，以生產具有特定特性的酒曲。

2.3添加大青葉對酒曲生物活性的影

添加大青葉對酒曲各種酶活力及發酵特性影響如圖3所示。

由圖3可知，酒曲糖化酶酶活隨著大青葉添加比例的增加而提高，添加9%大青葉時糖化酶最大值達到367 U/g，是不加葉樣品最大糖化酶酶活（70 U/g）的5.24倍。主要原因是大青葉促進霉菌的生長，而糖化酶活力與霉菌的生長繁殖密切相關，因此糖化酶活力隨霉菌快速增長而大幅提升。但液化酶則表現出相反的結果，其酶活隨大青葉添加量的增加而降低，添加量為9%時降低30%，原因可能是由于基質水含量過低降低霉菌代謝液化酶的能力，同時細菌、酵母生長受到大青葉抑制也不利液化酶的代謝，具體確證數據還需要后續作深入研究。另一方面，發酵力隨大青葉添加量增加而降低，當添加9%大青葉時發酵力為31.71 m L/（g·72 h），只達到不加葉樣品發酵力的10.3%，發酵力下降了接近90%。因為發酵力主要來源于活性酵母，添加大青葉抑制酵母的生長，使酵母生長量的降低，從而使發酵力隨之下降。添加大青葉后酯化力下降，從424 mg/（g·100 h）（不加葉）下降至85 mg/（g·100 h）（9%大青葉），下降達80%，原因主要是添加大青葉后導致酒曲水分下降，從而抑制酯化酶產率。可見，添加大青葉對酒曲發酵特性產生較大影響，體現為提升糖化酶活力，但降低發酵力、酯化力和液化酶活力，傳統酒曲生產中需要添加多種酒餅葉作為輔料，包括桂葉、大青葉、假鷹爪葉等，如果添加大青葉的比例過大將明顯降低酒曲發酵力、酯化力等指標，因此適當控制大青葉添加比例。

圖3　大青葉添加量對發酵過程中糖化酶活（a）、液化酶活（b）、發酵力（c）、酯化力（d）的影響Fig．3 Effect of Folium isatidis addition on saccharifying power（a），liquefying power（b），fermenting power（c）and esterifying powe r（d）during fermentation

2.4酒曲發酵過程中殘留揮發性成分分析

表2　添加不同比例大青葉的酒曲在發酵過程中的揮發性成分Table 2 Volatile com pounds of Jiuqu with different Folium isatidis addition during fermentation

由表2可知，添加大青葉使酒曲的揮發性成分明顯增多，由對照組的7種物質增加到11～17種物質，其中酯類物質從4種（1種甲酯和3種乙酯）增加至8種，新增的4種包括：辛酸-4-甲基苯酯、草酸-癸基苯基酯、9，12-十八碳二烯酸甲酯、棕櫚油酸甲酯等。這些酯并不是大青葉原有物質，表示是生物合成或轉化的結果。有研究表明，酒曲發酵的通氣狀況及基質成分會影響酯類物質的生成［16-17］，本實驗加入大青葉后對酒曲培養基的通氣條件及理化性質具有調節作用，有利于促進酒曲中酯類物質的生成。

對照組測出的4種酯在發酵中期都存在，發酵后期消減或消失，到第6天發酵結束時只剩2種，包括棕櫚酸乙酯和油酸乙酯。添加大青葉對該4種酯類代謝或合成有促進作用，第4天達到最大，這與酒曲的酯化力在第4天達到最大值（圖3）的結果吻合，可以解釋在第4天有大量酯類物質生成的原因，但后期出現分解現象，只殘留1種，棕櫚酸乙酯或油酸乙酯。新增的四種酯類成分均在發酵至第4天檢測出來，且在第6天達到最大值，與對照組的4種酯后期被消減的合成機制不同，這有利于保障酒曲產品最終的酯類成分。

在檢出的2種醇類物質中，新增了具有防腐功能的苯甲醇物質，其含量隨大青葉添加量增加而增加，當大青葉從4.5%增加至9%，苯甲醇值增加達3.76倍；相反，苯基乙醇（芳香類物質）含量則隨大青葉的添加量增大有較大幅度的降低，與不添加大青葉酒曲比較，添加9%大青葉時苯基乙醇下降幅度達到81.6%。在整個發酵過程中，兩種醇類物質均在第2～4天達到最大值，發酵后期有所減少，可推測這與物質揮發以及成分轉化反應有關。

另外，添加大青葉后還新增了其他幾種物質，包括n-十六酸、（Z，Z）-9，12-十八烷二烯酸、9，10-二氫化異長葉烯、2，2，4，4，6-五甲基庚烷、9-十八烯酰胺，其中9-十八烯酰胺的含量最大，這些成分將對形成酒曲特有風味起到重要作用。

3　結論

添加大青葉可調節酒曲基質結構較疏松、氣流擴散和水分揮發，對培養過程酒曲密度、含水量和酸度產生影響。隨著大青葉添加比例的增加，發酵過程酒曲密度、含水量和酸度下降趨勢加劇，影響酵母、細菌和霉菌的生長與代謝，表現為促進霉菌的生長，但抑制酵母和細菌的生長，提高糖化酶酶活，降低液化酶酶活、發酵力和酯化力等。傳統酒曲生產中需要添加多種酒餅葉作為輔料，包括桂葉、大青葉、假鷹爪葉等，如果添加大青葉的比例過大將明顯降低酒曲發酵力、酯化力等指標，建議酒廠在酒曲實際生產過程中適當控制大青葉添加比例。

添加大青葉后酒曲檢測出的揮發性物質比不添加的對照組明顯增多，包括新增4種酯類物質，還有苯甲醇和多種高級脂肪酸、烷、烯、酰胺等物質，但在新增的揮發性成分中沒有發現大青葉的原始成分，表明大青葉的揮發性成分不是直接殘留，而是在酒曲發酵中通過微生物代謝或轉化形成新的風味物質或功能成分，對酒曲的性能產生影響。本研究結果將為酒曲中添加大青葉輔料工藝提供科學依據，并為添加其他中草藥輔料工藝提供借鑒。

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Effect of Folium isatidis on Jiuqu fermentation

GU Xuefeng1，HE Songgui2，LIU Youqiang2，WU Zhenqiang1*
（1.School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China；2.Guangdong Jiujiang Distillery Co.，Ltd.，Foshan 528203，China）

The effect of Folium Isatidis（FI）addition on Jiuqu fermentation was discussed.The results showed that FI addition was beneficial for aeration and heat-transfer in the fermentation as well as regulating the high acidity through reducing the substrate density and loosening the substrate structure.As a result，FI addition can promote mold grow th in Jiuqu，whereas inhibit yeasts and bacteria growth at the mean time，which resulted in biological activity change.The impact effect was promotional to the FI addition.When FI addition was 9%，the saccharifying enzymes activity im proved 4.24 times，the liquefying power，fermenting power and esterifying power decreased 30%，90%and 80%，respectively.Accordingly，FI addition significantly increased volatile compounds in Jiuqu，esters compounds species increased from 4 to 8，besides，benzyl alcohols，higher aliphatic acids，alkanes，alkenes，am ides and some other alcohols were increased，which could contribute significant influence on Jiuqu flavor.

Jiuqu fermentation；Folium isatidis；microorganism；fermenting power；esterifying power

TS261．4

0254-5071（2016）05-0065-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．014

2016-03-10

廣東省江門市農業科技攻關計劃項目（20150160008347）

谷雪峰（1990-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程、酒類發酵。

吳振強（1963-），男，教授，博士，研究方向為發酵工程、天然產物發酵生物轉化。