優化陳米糖化液提高細菌纖維素產量的研究

李嘉宇，盧紅梅*，姜曉琳，張　媛，周　悅，金　葉

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

優化陳米糖化液提高細菌纖維素產量的研究

李嘉宇，盧紅梅*，姜曉琳，張媛，周悅，金葉

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

以木醋桿菌（Acetobacterxylinum）為發酵菌種，通過Plackett-Burman試驗設計確定了陳米糖化液培養基中酵母膏、KH2PO4、FeSO4、乙醇對木醋桿菌發酵產細菌纖維素具有顯著影響，并采用Box-Behnken試驗設計對各顯著影響因子進行優化，獲得最優的陳米糖化液發酵培養基配方為：在陳米糖化液培養基基料中加入酵母膏13.1 g/L、蛋白胨10 g/L、KH2PO45.7 g/L、MgSO43.1 g/L、FeSO40.3 g/L、檸檬酸0.3 g/L、無水乙醇4.0%。在此優化條件下，細菌纖維素的產量為7.08 g/L，是陳米糖化液培養基基料發酵產細菌纖維素（0.38 g/L）的18.6倍，比基礎發酵培養基細菌纖維素產量（4.80 g/L）提高了47.5%。

陳米；糖化液；細菌纖維素；木醋桿菌

陳米為隔年米，在存儲過程中，因氣溫、濕度、氧化、蟲蝕等因素的影響，無論是在外觀、營養方面，還是口感和味道都較之新米相差許多。近幾年來，我國糧食連年豐收，而且隨著人們生活水平不斷提高，對糧食的消費也在逐漸下降，導致大量陳米積壓。調查顯示，市場上陳米多過新米、散裝大米［1］。因此有必要對陳米、碎米及低品質秈米進行深加工、高值化利用。目前對陳米的研究有陳米粉可食性包裝薄膜［2］、陳米用于釀酒［3］、陳米造塑料［4］、大米粉液化糖化液發酵井岡霉素A［5］等。利用陳米生產細菌纖維素可以大幅度提高陳米附加值。

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為代表的少數微生物發酵而成的具有廣闊開發前景的生物材料［7］，如作為保健品和食品添加劑；提高紙張性能；用做生物醫學材料、多種組織器官（皮膚、血管、軟骨組織、骨組織、泌尿系統等組織）的重建材料、燃料電池、緩釋劑、復合材料等；還可應用在聲學器材、非織造布、離子交換膜和膜分離等諸多領域［8-11］。椰子水是最早用于生產細菌纖維素的原料，也是目前普遍使用的原料［12］，以椰子水為主要原料具有地域性和季節性限制，無法滿足市場擴增的需要。尋找替代椰子水的細菌纖維素原料成為研究的一大熱點［13-14］。

前期研究表明，陳米糖化液可用于培養細菌纖維素，但用陳米糖化液培養基基料為發酵培養基時，細菌纖維素的產量較低。因此，有必要通過優化陳米糖化液發酵培養基提高細菌纖維素產量。本研究通過Plackett-Burman及Box-Behnken試驗設計優化陳米糖化液發酵培養基，以期提高細菌纖維素產量并拓寬發酵細菌纖維素的原料范圍。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種及材料

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）：貴州大學貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室保藏；陳米：市售。

1.1.2試劑

α-1，4-葡萄糖水解酶（酶活力為50 000 U/g）：上海佳和生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純）：天津市登科化學試劑有限公司；氫氧化鈉、氫氧化鉀（分析純）：重慶茂業化學試劑有限公司；乙醇（分析純）：天津市富宇精細化工有限公司；苯酚（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；酒石酸鉀鈉（分析純）：成都金山化學試劑有限公司；硫酸、乙酸（分析純）：重慶川江化學試劑廠。

1.1.3培養基

斜面培養基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸1 g/L，KH2PO42 g/L，瓊脂20 g/L，121℃滅菌20 min。

種子培養基：蔗糖20 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO41 g/L，121℃滅菌20 min，滅菌冷卻后無菌條件下加入無水乙醇3%。

基礎培養基：蔗糖50 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨8.0 g，KH2PO44.3 g/L，MgSO42.5 g/L，121℃滅菌20 min，滅菌冷卻后無菌條件下加入無水乙醇3%。

陳米糖化液發酵培養基：在大米糖化液培養基基料中加入適量的酵母膏、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、檸檬酸、無水乙醇。

1.2儀器與設備

SPX-250型生化培養箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-b型數顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；101-1型電熱鼓風干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；FA2004N型精密電子天平：上海菁海儀器有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；UV-2550紫外-可見光分光光度計：日本島津公司。

1.3方法

1.3.1總糖含量的測定

（1）試劑配制

1 mg/m L葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取105℃下烘干至恒質量的葡萄糖1.000 0 g，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉移至1 000 m L容量瓶中，用蒸餾水定容至1 000 m L，混勻，4℃冰箱中保存備用。

3，5-二硝基水楊酸（DNS）試劑的配制：（1）甲液：將6.9 g重蒸酚溶解于15.2 m L 100g/LNaOH溶液中，并稀釋到70 m L，加入6.9 g亞硫酸鈉；（2）乙液：稱取255 g酒石酸鉀鈉，加入到300 m L 100 g/L NaOH溶液中，再加入880 m L 10 g/L 3，5-二硝基水楊酸溶液。將甲液與乙液混合即得黃色試劑，貯于棕色瓶中，在室溫下放置7～10 d后使用［15］。

（2）葡萄糖標準曲線的繪制

吸取0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L、1.2 m L、1.4 m L、1.6 m L葡萄糖標準溶液，分別置于25 m L比色管中，各加入2 m L DNS試劑，置于沸水浴中2 min，進行顯色，冷卻至室溫后，用蒸餾水定容至25 m L，搖勻，以空白試劑調零，在波長540 nm處測定吸光度值，以葡萄糖含量（C）為橫坐標，以吸光度值（A）為縱坐標繪制標準曲線，根據標準曲線回歸方程A=0.914 5C-0.004 93（R2=0.999 63）計算樣品中葡萄糖含量。

（3）樣品處理

將發酵液經4 000 r/m in離心20 min，取上清液5 m L于250 m L容量瓶中加入30 m L的蒸餾水，5 m L 6 mol/L HCl，在70℃水浴15 min，冷卻至室溫，調pH值至7～8，并定容至250 m L，作為試樣水解液備用。

（4）樣品測定

吸取水解液1.0 m L，按照標準曲線繪制操作方法測定吸光度值，根據標準曲線回歸方程計算水解液中葡萄糖含量，發酵液中總糖含量計算公式如下：

式中：C為由樣品吸光度值從標準曲線上查得的葡萄糖含量，mg/m L；K為樣液的稀釋倍數，50。

1.3.2陳米糖化液培養基基料制備

將一定量的陳米粉碎，按照料液比1∶12（g∶m L）加入蒸餾水，于80～90℃水浴鍋中糊化30 min，降溫至60℃，用1 mol/L的鹽酸調節pH值為4.0～4.5，添加300 U/g α-1，4-葡萄糖水解酶進行糖化（取少量試液于試管中，滴加少量碘液觀察是否變藍，如不變色即已糖化完全。），糖化完全后靜置，取上層澄清液［16］，經DNS法測定糖化液中總糖含量，添加蒸餾水將糖化液稀釋至總糖含量為50 g/L。即為陳米糖化液培養基基料。

1.3.3培養方法

菌種活化：挑取適量原代木醋桿菌（A.xylinum）接種于斜面培養基中，在28℃恒溫培養箱中培養72 h。

液體種子培養：準確量取50 m L液體種子培養基于250 m L的三角瓶中，取三環活化好的木醋桿菌接入種子培養基中，28℃、100 r/min搖床培養24 h。

靜態發酵培養：準確量取50 m L發酵培養基于250 m L三角瓶中，冷卻后接入木醋桿菌種子液13.5%，置于30℃下靜置培養192 h。

1.3.4細菌纖維素產量測定

細菌纖維素膜的處理：收集細菌纖維素膜，用蒸餾水反復沖洗除去膜表面的培養基及雜質后，置于80℃，0.1 m ol/L的NaOH溶液中，維持2 h（若膜較厚可以適當延長時間，每2 h更換一次NaOH溶液），以除去菌體蛋白和殘余培養基，至膜呈乳白色半透明狀，冷卻至室溫后用0.5%（V/V）乙酸中和30 min，蒸餾水充分洗滌，至膜呈中性，貼至塑料板上，在80℃條件下干燥至恒質量［17］。細菌纖維素產量計算公式如下：

1.3.5Plackett-Burman試驗設計

根據微生物發酵細菌纖維素的一般影響因素和前期的初步試驗，選取蛋白胨、酵母膏、KH2PO4、MgSO4、FeSO4、檸檬酸、無水乙醇為試驗因素，以細菌纖維素干質量（Y）為評價指標，設計Plackett-Burman試驗，利用Design Expert 7.0軟件進行數據分析及模型建立。Placktt-Burman試驗因素與水平如表1所示。

表1　Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Fac tors and levels of Plackett-Burm an experim ents

1.3.6Box-Benhnken試驗設計

依據Plackett-Burman試驗確定的關鍵因素與水平，采用Box-Benhnken試驗設計對發酵培養基成分進行響應面分析，以獲得細菌纖維素高產量的培養基組成成分。Box-Behnken試驗因素與水平見表2。

表2　Box-Behnken試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments

2　結果與分析

2.1陳米糖化液培養基基料發酵產細菌纖維素

在優化培養基前，使用陳米糖化液培養基基料培養木醋桿菌生產細菌纖維素，30℃培養8 d，細菌纖維素產量為0.38 g/L，利用基礎培養基時細菌纖維素產量為4.80 g/L。陳米糖化液基料發酵的細菌纖維素產量遠遠小于基礎培養基的產量。由于陳米糖化液基料培養基與基礎培養基的總糖含量都為50 g/L，說明導致陳米糖化液基料培養細菌纖維素產量低的原因是除糖類外的其他營養成分不足，用陳米糖化液培養木醋桿菌生產細菌纖維素時，應該對培養基進行優化。

2.2Plackett-Burman試驗篩選陳米糖化液培養基主要因素

以細菌纖維素產量（Y）為響應值，按照Plackett-Burman試驗設計進行12組試驗，Plackett-Burman試驗設計及結果見表3。利用Design Expert 7.0對Plackett-Burman試驗數據進行分析，各個因素的效應及顯著性如表4所示。

表3　Plackett-Burman試驗設計及結果Table 3 Design and results of Plackett-Burm an experiments

表4　Plackett-Burman試驗主效應分析Table 4 Analysis of main effects for the Plackett-Burm an experim ents

由表4中P值的大小可知，陳米糖化液培養基中各因素對菌株發酵生產細菌纖維素顯著影響的有：酵母膏（P=0.068 3）、KH2PO4（P=0.076 5）、FeSO4（P=0.051 1）和無水乙醇（P=0.001 8），可以作為進一步優化的關鍵因素。

2.3Box-Behnken試驗設計與響應面試驗分析

在Plackett-Burm an試驗的基礎上，對影響木醋桿菌在陳米糖化液培養基中合成細菌纖維素的效應顯著因素按Box-Behnken試驗設計進行29組試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表5。利用Design-Exper 7.0軟件對試驗數據進行多元回歸擬合，得到細菌纖維素產量（Y）對自變量酵母膏（X1）、KH2PO4（X2）、FeSO4（X3）、無水乙醇（X4）的多元回歸方程：Y=6.59+0.28X1-0.23X2-0.014X3+0.075X4-0.027X1X2-9.500E-003X1X3-9.000E-003X1X4+0.030X2X3+ 0.25X2X4+0.012X3X4-0.65X12-0.36X22-0.23X32-0.87X42。對模型進行顯著性檢驗，方差分析結果見表6。

由表6可知，此模型P＜0.000 1說明該回歸方程極顯著，失擬項不顯著（P=0.272 1），說明模型與實際擬合良好，自變量與響應值有顯著線性關系，預測值和試驗值之間具有高度的相關性（R2=0.930 6），可以應用于細菌纖維素發酵生產的理論預測。

表5　Box-Behnken試驗設計及結果Table 5 Design and results Box-Behnken experim ents

表6　回歸方程的方差分析Table 6 Variance analysis of regression equation

在模型參數中，X1、X2、X12、X22、X32、X42對細菌纖維素產量影響極顯著。在獲得回歸非線性模型和響應面之后，為得到培養基最佳的質量濃度，對所得的回歸擬合方程各自變量分別求極值，得極值點分別為：X1=0.24，X2=-0.32，X3=1，X4=0.04，即酵母膏添加量為13.1g/L，KH2PO4添加量為5.7 g/L，FeSO4添加量為0.3 g/L無水，乙醇添加量為4.04%。最優的培養基發酵條件下，理論細菌纖維素的最大產量為6.66 g/L。優化后在陳米糖化液培養基基料中加入酵母膏13.1g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO45.7g/L、MgSO43.1g/L、FeSO40.3 g/L、檸檬酸0.3 g/L、無水乙醇4.0%配制成陳米糖化液培養基。在此優化條件下進行驗證試驗，優化后的發酵培養基細菌纖維素平均產量為7.08 g/L，接近預測值，是陳米糖化液培養基基料產細菌纖維素的18.6倍（0.38 g/L），比基礎發酵培養基細菌纖維素產量（4.80 g/L）提高了47.5%。

3　結論

結合陳米高值化利用和細菌纖維素培養基質更新的迫切需求，對陳米糖化液培養基產細菌纖維素進行了試驗，但僅用陳米糖化液基料培養細菌纖維素時，由于缺乏除碳源外的營養成分，產量僅為0.38 g/L，遠低于基礎培養基發酵細菌纖維素的產量4.80 g/L。本研究通過采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計，對陳米糖化液培養基的主要組分進行篩選，并優化各組分的配比，獲得優化的陳米糖化液培養基成分配比為：在陳米糖化液培養基基料中加入酵母膏13.1 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸二氫鉀5.7 g/L、硫酸鎂3.1 g/L、硫酸亞鐵0.3 g/L、檸檬酸0.3 g/L、無水乙醇4%。在優化培養基條件，細菌纖維素的產量為7.08 g/L，是陳米糖化液培養基基料發酵細菌纖維素產量的18.6倍，比基礎培養基發酵細菌纖維素產量提高了47.5%。

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Optim ization of stocked rice saccharification liquid for im proving bacterial cellulose yield

LI Jiayu，LU Hongmei*，JIANG Xiaolin，ZHANG Yuan，ZHOU Yue，JIN Ye
（College of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

Using Acetobacter xylinum as fermentative strain，yeast extract，KH2PO4，FeSO4and ethanol had obvious effect on bacterial cellulose produced from A.xylinum by Plackett-Burman experiments.The factors were optim ized by Box-Behnken experiments，and the optimum formula of stocked rice saccharification liquid fermentation medium were yeast extract 13.1 g/L，peptone 10 g/L，KH2PO45.7 g/L，MgSO43.1 g/L，FeSO40.3 g/L，citric acid 0.3 g/L，absolute ethanol 4.0%.Under the conditions，the yield of bacterial cellulose was 7.08 g/L，which was 18.6 times of the bacterial cellulose yield（0.38 g/L）in the basic material of stocked rice saccharification liquid medium and was increased by 47.5%than that（4.80 g/L）of basis fermentation medium.

stocked rice；saccharification liquid；bacterial cellulose；Acetobacter xylinum

Q815

0254-5071（2016）05-0047-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．010

2016-02-14

國家自然科學基金（31160338）；貴州大學“SRT計劃”項目（貴大SRT字［2014］107號）

李嘉宇（1996-），女，本科生，研究方向為生物材料。

盧紅梅（1967-），女，教授，博士，研究方向為食品生物技術。