窖泥高產己酸菌分離鑒定及培養條件優化的研究

彭　兵，祝　熙，李忠奎，張寶年，程　偉，陳興杰，謝國排，楊牢記，黃訓端，張部昌*

（安徽大學金種子酒業產業技術研究院，安徽合肥230601）

窖泥高產己酸菌分離鑒定及培養條件優化的研究

彭兵，祝熙，李忠奎，張寶年，程偉，陳興杰，謝國排，楊牢記，黃訓端，張部昌*

（安徽大學金種子酒業產業技術研究院，安徽合肥230601）

濃香型白酒的主體香味物質是己酸乙酯，己酸菌是重要的功能菌種。該研究從優質窖泥中分離獲得了高產己酸菌株，命名為JZZ，該菌是革蘭氏陽性桿菌，經形態學和16S rDNA序列鑒定，屬于克氏梭菌（Clostridium kluyveri）。通過培養條件考察，該己酸菌最適培養條件為接種量5%，裝樣量90%，培養溫度37℃，pH值為6.5。在最適培養條件下，菌株JZZ的己酸產量均可達到4.36 mg/m L。

窖泥；己酸菌；分離；鑒定；培養條件

白酒釀造在我國有著悠久的歷史，因原料、酒曲和生產工藝以及自然環境等因素的差別，形成了各具特色、風格迥異的多種香型的白酒，其中濃香型白酒具有芳香濃郁、綿柔甘洌、香味協調、入口甜、落口綿、尾凈余長等特點，成為白酒行業的主流產品［1］。構成濃香型酒典型風格的主體成分是己酸乙酯，這種成分含香量較高且香氣突出。在傳統固態濃香型白酒釀造過程中，窖泥的作用是至關重要的，窖泥微生物的種類、數量、種群間的相互作用以及代謝的多樣性直接影響著白酒的質量，其中就包含大量的己酸菌。己酸菌含量的多少以及產己酸能力的高低都直接影響著濃香型大曲酒酒體風格的形成［2-3］。己酸菌代謝所產生的己酸在白酒中不僅起到呈香、助香、減少酒體刺激的作用，而且可以與酒曲發酵產生的酒精發生酯化反應，生成濃香型白酒的所特有的主體香成分己酸乙酯，從而改善濃香型白酒的風味及口感，影響濃香型白酒的風格和質量［4-5］。因此濃香型白酒窖泥微生物群落研究一直是業界研究熱點，特別是一些主要功能菌的分離純化及窖池微生物的群落特征進展迅速［6-8］。趙輝等［9］從濃香型白酒窖泥中分離出3株高產己酸的兼性厭氧細菌，并用氣相色譜法檢測其己酸產量分別為2.13 m g/m L、1.70 mg/m L和1.03 mg/m L。熊俐等［10］分離出一株高產己酸菌，通過誘變，用醋酸銅比色法測得其己酸產量達到9.02 mg/m L。

本實驗從曲酒發酵池的優質窖泥中分離、純化、篩選出高產己酸的己酸菌，并進行分子生物學鑒定，考察其高產己酸培養條件，為窖池養護及人工窖泥培養提供優質的功能菌株。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

窖泥：取自某酒廠13個優質濃香型大曲酒發酵池，分別命名為JKY1-JKY13。

1.1.2試劑

硫酸銨、磷酸氫二鉀、醋酸鈉、碳酸鈣、Fe2（SO4）3、乙醇、牛肉膏、NaCl、細菌基因組DNA提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母粉、蛋白胨：英國OXOID公司；厭氧袋、耗氧劑：日本MGC公司；己酸（色譜純）、內標物2-乙基丁酸（色譜純）：成都西亞試劑公司；乙醇、乙醚：國藥集團化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

1.1.3培養基

乙醇醋酸鈉培養基（ethanol acetic acid-Na medium，EAM）：NaAc 5 g、酵母膏1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、K2HPO40.4 g、（NH4）2SO40.5 g、CaCO310 g，蒸餾水1 L，自然pH；121℃滅菌20 m in，乙醇2.0%（滅菌后使用前加入）。

LB培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.4，121℃滅菌20 m in。

1.2儀器與設備

LRH-250F生化培養箱、DHG-9145A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；Velocity 18R臺式冷凍離心機：澳大利亞Dynamica公司；Spectramax 384plus分光光度計：美國MD公司；2010型氣相色譜儀（配氫火焰離子化檢測器、全自動進樣器、自動進樣針）：日本島津公司；DB-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國安捷倫公司。

1.3實驗方法

1.3.1高產己酸菌的分離純化

EAM培養基第一次富集：培養基試管裝液量90%，加入1 g窖泥，80℃水浴熱處理10 m in，封口膜封口，37℃培養7 d。分別取第一次富集菌液2 m L，加2 m L 2%CuSO4，1 m L乙醚，搖勻，靜置封層，觀察乙醚層顯色反應（硫酸銅顯色法）［9］，將OD值較高的組別進行氣相色譜法復測，然后將氣相色譜法復測己酸產量較高的組別進行第二次富集。第二次富集的培養液，吸取1～9 m L的無菌水中，依次稀釋到10-4稀釋度，選取10-3和10-4的菌液，吸取0.2 m L到已倒好的分離用平板培養基上，每個梯度重復3次，涂勻后放置于真空干燥箱中，37℃培養7 d。然后在稀釋涂平板的平皿上挑取單菌落挑至裝有EAM液體培養基的15 m L試管中（裝樣量90%）中37℃厭氧培養7 d。用硫酸銅顯色法測定波長680 nm條件下的吸光度值，對發酵液初篩后，氣相色譜法進行己酸菌己酸產量的測定。

1.3.2菌株鑒定

單菌落形態觀察，經革蘭氏染色后鏡檢。

提取菌株基因組，PCR擴增16S rDNA片段，聚合酶鏈反應（polymerasechain reaction，PCR）擴增程序：95℃、5min，95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、90 s，24個循環，72℃、10 min。由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行測序，提交美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI），通過基本本地隊列搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比較，用MEGA6軟件構建系統發育樹［11］。

1.3.3高產己酸菌培養條件的研究

將研究中挑選到的高產己酸菌分別按照2%、5%、10%、15%的種子液接種量接種到pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 EAM液體培養基的15 m L試管，裝樣量分別為60%、70%、80%、90%、100%，分別在36℃、37℃、38℃、39℃、40℃厭氧培養7 d后，考察接種量、pH值、裝液量及培養溫度對己酸產量的影響，每個樣品3個重復。

1.3.4己酸產量的測定

采用氣相色譜法檢測己酸產量，氣相色譜條件為進樣口溫度240℃；柱箱起始溫度：100℃（1 min）；升溫速率：10℃/min；柱溫終溫度：220℃（2 min）；檢測器溫度250℃；氣體流量：氫氣40 m L/m in，空氣400 m L/min，尾吹氣30 m L/min；進樣方式：分流進樣，分流比20∶1；進樣體積：1 μL。

內標液的配制：準確稱取內標物2-乙基丁酸原液0.185 g于100 m L容量瓶中，用體積分數為60%乙醇水溶液定容至100m L，配制成1.85mg/m L 2-乙基丁酸內標液待用。

2　結果與分析

2.1高產己酸菌分離

本研究利用硫酸銅比色法檢測己酸菌的己酸產量，對菌株進行初篩，篩選到一株穩定高產的己酸菌，命名為JZZ，然后對菌株JZZ的己酸產量用氣相色譜法進行復測，結果見表1。由表1可知，菌株JZZ的己酸產量的6次檢測結果分別為4.33 mg/m L、4.25 mg/m L、4.28 mg/m L、4.55 mg/m L、4.34 mg/m L、4.42 mg/m L，平均值為4.36 mg/m L，菌株JZZ是一株高產己酸菌。

表1　菌株JZZ己酸產量的復測Table 1 Retest of caproic acid yield for strain JZZ

2.2菌株JZZ的菌落形態觀察

經過菌落形態及革蘭氏染色觀察，結果見圖1。由圖1可知，菌株JZZ為革蘭氏陽性桿菌，頂端有芽孢，菌落呈白色圓形，扁平，表面光滑且周圍有較為明顯的透明圈。

圖1　菌株JZZ的菌落形態（A）及細胞形態（B）Fig．1 Colonial morphology（A）and cell morphology（B）of strain JZZ

2.3篩選菌株JZZ的16S rDNA鑒定結果

經上海美吉生物醫藥科技有限公司測序分析，得到菌株JZZ的16S rDNA序列信息如下：

GTGGGTAACCTGGCTCAAAGAGGGGGATAGCC TCCCGAAAGGGAGATTAATACCGCATAAAAGGTAAATATCGCATGGTAAATACCTTAAAGGAGAAATCCG CTTTGAGATGGGCCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGA GGGATAAAAGCCCCCCAAGGCGACGATGCGTAGCC GACCTGAGAGGGTGAACGGCCACATTGGAACTGAG ATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCA ACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAA AGCTCTGTCATCCGGGACGATAATGACGGTACCGG AAGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGAAT TACTGGGCGTAAAGGGTGTGCAGGCGGATATTTAA GTGAGATGTGAAAGACCCGGGCTTAACCCGGGCAG TGCATTTCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGG AGAACGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGATTC TCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTG GGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACG CCGTAAACGATGAGTACTAGGTGTAGGGGGTATCG ACCCCCCCTGTGCCGCAGTAAACACAATAAGTACTC CGCCTGGGAAGTACGATCGCAAGATTAAAACTCAA AGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGCGGAGCA TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACC TGGACTTGACATCCCCTGAATAACTCGTAATGGAGG AAGCCCTTCGGGGCAGGGAGACAGGTGGTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAG TCCTGCAACGAGCGCAACCCCTGTCGTTAGTTGCCA TCACGTAAAGGTGGGCACCCTAACGAGACTGCCGC GGTTAACGTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAAT CATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCAACACACGTGCT ACAATGGGCAGAACAGAGAGAAGCAATACCGCGAG GAGGAGCAAATCTCAAAAACTGCCCCCAGTTCGGA TTGCAGGCTGAAACCCGCCTGCATGAAGTTGGAGTT GCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATA CGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCC。

將菌株JZZ的16S rDNA序列在NCBI中進行同源性比較，同源性較高的為克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri），同源性＞99%。采用軟件構建系統發育樹，結果見圖2。

圖2　菌株JZZ的16S rDNA的系統發育樹Fig．2 Phylogenetic tree of 16S rDNA of strain JZZ

一般認為，在細菌分類學上16S rDNA的同源性＞97%的為屬內同種。由圖2結果綜合菌株JZZ的形態與分子生物學特征可知，菌株JZZ鑒定為克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri）［12-13］。

2.4高產己酸菌培養條件的研究

通過對接種量、裝樣量、培養溫度及pH分別設置變量，對菌株JZZ的培養條件進行優化，經氣相色譜法測定己酸產量的變化，結果見圖3。

圖3　不同接種量（A）、裝樣量（B）、培養溫度（C）及pH（D）對菌株JZZ己酸產量的影響Fig．3 Effect of different inoculum（A），volume of liquid（B），culture tem perature（C）and pH（D）on caproic acid yield of strain JZZ

由圖3A可知，培養7 d后，接種量為5%比2%的己酸產量高，雖然更高的接種濃度己酸產量還在增長，但增長幅度較小，所以5%是合適的接種量。由圖3B可知，培養7 d后，乙酸產量裝樣量從60%到100%呈遞增趨勢，在裝樣量＜90%時增幅較大，而90%～100%時增幅較小，綜合考慮實驗的操作方便性等原因認為90%是合理的裝樣量。由圖3C可知，培養7 d后，培養溫度為37℃時己酸產量最高，所以37℃是最合適的培養溫度。由圖3D可知，pH 6.5條件下培養7 d后，產己酸量最高，所以pH 6.5是最佳pH。

3　結論

本研究通過對某濃香型窖池窖泥分別進行富集、篩選、梯度稀釋等工作得到一株高產己酸菌，并命名為JZZ。通過菌落形態、革蘭氏染色及16S rDNA分子測序對菌株JZZ進行鑒定，得到的結果為該菌為革蘭氏陽性桿菌，屬于克氏梭狀桿菌（Clostridium kluyveri）。通過對其產己酸條件的優化，得到該菌的最適培養條件為pH值為6.5，接種量為5%，裝樣量為90%，培養溫度為37℃。通過氣相色譜法對其己酸產量進行檢測，在最適培養條件下，菌株JZZ的己酸產量均可達到4.36 mg/m L。

在傳統的濃香型白酒生產過程中，窖泥經過長時間的使用會出現不同程度的板結和老化，窖泥中的己酸菌等功能菌會出現產己酸功能的衰退及數量的減少，需要定期通過加入含有高產己酸菌養護液對老化的窖泥進行養護，在人工窖泥快速培養中高產己酸菌將起到關鍵作用［14-16］。本實驗篩選得到的高產己酸菌JZZ用于窖泥的日常養護和人工窖泥的快速培養，可改善窖泥的養護效果，縮短人工窖泥老熟的周期，降低生產成本。由于己酸菌的主要產物己酸，是濃香型白酒中關鍵的風味產物己酸乙酯的前體，所以本研究對于提高和改善濃香型白酒的質量有重要應用價值。

［1］徐發.我國白酒行業現狀和發展趨勢分析［D］.合肥：合肥工業大學碩士論文，2010.

［2］周恒剛.老窖泥培養［M］.北京：中國計量出版社，1998：83-94.

［3］曹新志，黃春萍，熊俐，等.共培養對己酸菌生長代謝影響的初步研究［J］.中國釀造，2010，29（11）：35-38.

［4］高素潔，曹亞彬，郭麗妹.己酸菌的分離篩選及發酵條件的研究［J］.生物技術，1997（1）：35-37.

［5］韓珍瓊，程道梅.濃香型大曲酒窖泥己酸菌純培養條件的研究［J］.中國釀造，2005，24（12）：19-22.

［6］郭藝山，鎮達，陳茂彬，等.己酸菌工業擴大培養條件的優化［J］.釀酒，2010，37（1）：39-42.

［7］黃芳.己酸菌的分離純化及生長規律的研究［J］.釀酒，2008，35（4）：41-43.

［8］陳翔，王亞慶，邵海燕.己酸菌純種培養與混合培養技術在窖泥生產中的應用［J］.釀酒，2009，36（3）：35-37.

［9］趙輝.濃香型白酒窖泥中高產己酸兼性厭氧細菌的分離鑒定［J］.食品科學，2012，33（5）：177-182.

［10］熊俐，胡洋，劉俊，等.窖泥己酸菌的分離培養與誘變選育［J］.四川理工學院學報，2010，23（3）：324-327.

［11］柳林，韋術敏，程仕偉，等.產膠原酶的琥珀葡萄球菌分離鑒定及其培養優化研究［J］.中國釀造，2016，35（1）：62-67.

［12］姚萬春，唐玉明，任道群，等.不同泥厚窖池窖泥主要功能菌及代謝產物研究［J］.中國釀造，2012，31（12）：49-53.

［13］陳華紅，李文均，徐麗華，等.1株嗜堿克氏菌屬菌株的分離及系統發育分析［J］.云南大學學報：自然科學版，2004（S1）：208-211.

［14］趙輝，王葳，敞顏，等.一種濃香型白酒窖泥己酸菌增殖培養基及其制備方法：CN103194416A［P］.2013-07-10.

［15］張學英，章發盛.人工窖泥的培養及應用［J］.釀酒，2011，38（2）：69-71.

［16］謝國排.濃香型大曲酒窖泥概述［J］.中國釀造，2011，30（1）：153-154.

Isolation and identification of the strains with high caproic acid yield from pit mud and optim ization of cultural conditions

PENG Bing，ZHU Xi，LI Zhongkui，ZHANG Baonian，CHENG Wei，CHEN Xingjie，XIE Guopai，YANG Laoji，HUANG Xunduan，ZHANG Buchang*
（Institute of Industry and Techno logy of Anhui University-Golden Seed W inery，Hefei 230601，China）

Ethyl caproate is primary flavor component of Luzhou-flavor liquor（China Baijiu），and caproic acid bacteria are the important functional strains.The strains w ith high caproic acid yield were isolated from the fine pit mud and named JZZ.The strains were gram-positive bacilli and were identified as Clostridium kluyveri by identification of morphology and 16S rDNA sequence.By researching culture conditions，the optimum culture conditions of caproic acid bacteria were inoculum 5%，liquid volume 90%，culture temperature 37℃and pH 6.5.Under the optimum conditions，the caproic acid yield of strain JZZ could be up to 4.36 mg/m l.

pit mud；caproic acid bacteria；isolation；identification；culture conditions

TS261

0254-5071（2016）05-0043-04

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．009

2016-02-04

金種子人工窖泥快速培養技術研究（Y 06099204）；安徽大學2015年百門精品素質課程建設項目（ZLTS2015233）

彭兵（1970-），男，高級工程師，本科，主要從事釀造技術研究工作。

張部昌（1965-），男，教授，博士，主要從事生物工程研究工作。