動態發酵合成球形細菌纖維素條件研究

章　翠，畢繼才，陳華美，王艷梅，劉四新，李從發*

（海南大學食品學院，海南海口570228）

動態發酵合成球形細菌纖維素條件研究

章翠，畢繼才，陳華美，王艷梅，劉四新，李從發*

（海南大學食品學院，海南海口570228）

細菌纖維素（BC）是優良的新型生物材料，尤其以球形BC為代表，在各領域應用廣泛。目前，動態發酵產BC多以不規則團塊狀、星球狀、絲狀為主，應用范圍較局限。故通過控制生產條件，獲得均勻度較高的球形BC有著迫切的需要。在動態發酵時，以椰凍駒形桿菌（Komagataeibacter nataicola）Y19作為生產菌株，以中等大小BC的質量及數量百分比為考察指標，研究轉速、發酵液液深及發酵容器直徑引起的供氧效率及剪切力變化對動態發酵產球形BC合成規律的影響。結果表明，供氧效率提高、剪切力增大時，可使球形顆粒變小，顆粒數量增加。在發酵容器直徑為6.0 cm，液深為2.40～2.75 cm，轉速為130 r/m in時，中球BC質量與數量百分比均＞40%，均勻度最佳。

球形細菌纖維素；球粒細菌纖維素形貌；動態發酵

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）具有高化學純度、高聚合度［1］、高結晶度、吸水性好、持水力強、良好的生物相容性、超精細的網狀結構和生物降解［2-4］等優于植物纖維素的特點，使其在生物醫藥、化妝品［5］、造紙、食品工業等領域有著廣闊的應用前景［6-8］。而球形BC則具有更大的比表面積及更多的納米級空隙，賦予其更高的細胞親和性［9］及吸附能力，HU M等［10］在球粒型BC上培養人成骨細胞，發現其能快速地吸附和生長，具有良好生物相容性。ZHU H X等［11］還報道了用球形BC吸附牛血清白蛋白和鉛離子（Pb+）的實驗，發現其不僅吸附好，而且洗脫率高，洗脫率分別達到92.1%和75.2%，顯示了良好的重復利用的特點。

BC主要有靜態培養和動態培養兩種發酵方式［12］。靜態發酵時可在發酵液表面收獲凝膠態膜狀纖維素產物。但具有諸多缺點，如所需勞動力大，生產效率低［13］，且發酵占用空間大、發酵周期長、易感染雜菌、產品質量無法得到保證等。目前，動態發酵生產細菌纖維素主要包括搖瓶培養、攪拌式反應器、氣升罐、轉盤式反應器等［14］。動態法產生的細菌纖維素分散在發酵液中，產量較低，且所產BC形態各異，多以星球狀、不規則團塊狀、無規則顆粒狀或絲狀為主，以及少數的球形BC。目前球形BC在各領域的應用價值較高，但由于生產的不穩定性［15］，限制了其廣泛的應用。只有優化發酵條件，獲得大小適中、規則均勻又數量多、產量高的球粒型BC，才能獲得更大的應用前景及應用價值。CZAJA W等［9］發現通過控制合適的振蕩條件，利用木醋桿菌（Acetobacter xylinum）NQ-5可獲得直徑Φ=5 mm的球形纖維素產物，并推測在動態培養過程中，振蕩產生的剪切力，使產生的纖維絲相互交織，并折疊成球形顆粒。YANG H等［16］通過控制木醋桿菌（A.xylinum）JCM 9730（ATCC 700178）動態發酵時搖床轉速、錐形瓶及裝液量等條件，可獲得接近球形的細菌纖維素顆粒。殷智超［17］研究發現動態發酵培養過程中，通氣量過大，細菌數量增多，但纖維素產量卻極低。而適當提高發酵中期的通氣量，可以克服發酵過程中粘度增加對溶氧量的影響，從而獲得較高的BC產量。

目前對于球形BC的均勻度的評價還較少，余敏華等［14］以0.5～0.8 cm顆粒的產率為考察指標，對顆粒的均勻度進行較為簡單的判斷。由于細菌纖維素濕質量稱量時誤差較大，故本實驗產量均以干質量進行評價，首先按所合成纖維素球粒的規格大小對產物進行分類，以中球質量及數量百分作為均勻度的考察指標，并通過分析不同發酵條件下不同規格球形BC百分比的變化趨勢，研究發酵條件對動態產球形BC顆粒大小的影響情況，為動態發酵合成球形BC未來實現規模化生產奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

椰凍駒形桿菌（Komagataeibacter nataicola）Y 19，海南大學食品學院食品生物技術研究室保藏。

發酵椰子水：選取市售成熟椰子，取破殼后的椰子水，用八層紗布濾去雜質后，置于10 L的潔凈塑料桶中，在室溫條件下進行預發酵7 d的處理，再以干凈礦泉瓶分裝、置于-20℃冷柜凍存備用。

1.1.2試劑

椰子水、蔗糖為市售；MgSO4、（NH4）2SO4、KH2PO4、NaOH、酵母提取物、一水合檸檬酸：廣州化學試劑廠；蛋白胨（生化試劑）：湛江市光華化學廠；無水葡萄糖：國藥集團化學試劑有限公司。試驗所用試劑均為分析純。

1.1.3培養基

斜面試管培養基：（NH4）2SO43 g/L，MgSO40.3 g/L，KH2PO40.3 g/L，新鮮椰子水50%（V/V），瓊脂2.0%～2.5%，pH 5.0，加糖至可溶性固形物（糖度）50 g/L。

液體發酵種子培養基：（NH4）2SO43g/L，MgSO40.3g/L，KH2PO40.3 g/L，預發酵椰子水70%（V/V），pH3.8，加糖至可溶性固形物（糖度）50 g/L。

HS（Hestrin Schramm）培養基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母提取物5 g/L，Na2HPO4·12H2O 2.7 g/L，一水合檸檬酸1.15 g/L，pH 6.0。

上述培養基均于121℃滅菌20 min。

1.2儀器與設備

Y 5-840-1超凈工作臺：上海博訊實業有限公司；ZHWY-2112B恒溫培養振蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；G154DW立式自動壓力蒸汽滅菌器；致微（廈門）儀器有限公司；PB303-N電子精密天平；上海安亭科技儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1細菌纖維素的動態發酵

將斜面保藏菌株Y 19活化后接一環菌苔于液體發酵種子培養基（裝液量40m L/100m L）中，30℃靜置培養24h制成種子液。按2%接種量接入HS培養基（裝液量80m L/200m L）中，30℃、130 r/min，搖床培養7 d。

1.3.2轉速對動態發酵合成球形BC的影響

在HS培養基（裝液量80m L/200m L）中接種后，分別在50 r/min、80 r/min、110 r/min、120 r/min、130 r/min、170 r/min、200 r/m in，30℃動態培養7 d，測定BC產量。

1.3.3培養基液體深度對動態發酵合成球形BC的影響

裝液量分別為30 m L/200 m L、40 m L/200 m L、50 m L/ 200m L、60m L/200m L、70m L/200m L、80m L/200m L、90m L/ 200 m L、100 m L/200 m L、110 m L/200 m L、120 m L/200 m L、130m L/200m L、140m L/200m L液體培養基，使液深呈現梯度，其依次為1.00 cm、1.35 cm、1.70 cm、2.05 cm、2.40 cm、2.75 cm、3.10 cm、3.45 cm、3.80 cm、4.15cm、4.50 cm，30℃、130 r/m in動態培養7 d，測定BC產量。

1.3.4容器直徑對動態發酵合成球形BC的影響

選用不同型號的燒杯，其杯身直徑分別為4.0cm、4.9 cm、6.0 cm、6.8 cm、8.2 cm、9.0 cm、10.5 cm。液深為2.8 cm，30℃、130 r/m in動態培養7 d，測定BC產量。

1.3.5細菌纖維素產量測定

從培養基中取出纖維素，蒸餾水沖洗后，用0.1 mol/L NaOH溶液80℃浸泡30 min，再用蒸餾水沖洗，如此反復，直至纖維素膜呈乳白色半透明，然后使用0.5%乙酸浸泡以中和NaOH，再用蒸餾水沖洗至中性，將其置于無菌去離子水中，備用。以上處理均設置3個重復。將空白平板置于85℃干燥箱烘干至恒質量，記錄質量為W1，而后將清洗過的BC置于平板上，烘干至恒質量，記錄質量為W2，所產BC干質量為（W2-W1），本實驗均采用干質量來描述細菌纖維素的產量。

1.3.6球形BC的描述和評價方法

不同大小的球形BC有不同的應用途徑，根據所需大小的球形BC，可設定不同規格，現認為球形BC直徑在0.5～0.8 cm范圍時大小適中。本實驗以獲得直徑為0.5～0.8 mm之間球形BC為目標，將獲得的BC，于水中先后過0.8 cm和0.5 cm孔徑鐵制分類篩，將球形BC按照顆粒直徑大小分為3個規格：小球BC直徑（Φ＜0.5 cm）、中球BC直徑（0.5≤Φ＜0.8 cm）和大球BC直徑（Φ≥0.8 cm）。

為反映所合成球形BC顆粒的均勻程度，以3種直徑的BC顆粒在全部BC產物中質量及數量占比來描述。當中球BC質量及數量百分比達40%以上，認為大小均勻一致，其占百分比越高，均勻度越高。不同大小球形BC占總BC產量及數量百分比的計算公式如下：

式中：m1為所有小球的干質量，g；m2為所有中球的干質量，g；m3為所有大球的干質量，g；m為總BC產量干質量，g。

式中：N為所產BC總顆粒數；N1為小球BC的顆粒數；N2為中球BC的顆粒數；N3為大球BC顆粒數。

2　結果與分析

動態發酵合成的BC根據發酵條件而呈多樣化形態，只有大小適中、規則均勻又數量多、產量高的球粒型BC能有更大的應用價值。前期實驗表明動態發酵合成球形BC的產量、外觀形貌、均勻程度等與菌株、接種量、轉速、裝液量、發酵時間、發酵容器、以及外援添加物等關系密切，本實驗著重研究了影響搖瓶培養的供氧效率及剪切力的幾個因素如搖床轉速、培養液深度及發酵容器直徑對動態發酵條件合成球形BC的產量和質量情況，尤其是均勻度的情況。

2.1轉速對動態發酵產球形BC合成情況的影響

2.1.1轉速對動態發酵產球形BC形貌的影響

轉速對球形BC具有顯著的影響，通過改變動態發酵時的轉速，可提高動態發酵培養時的供氧效率及剪切力，從而獲得一系列的球形BC，結果如圖1所示。通過對球形BC形貌、產量分析，大小數量比率等數據，探究供氧效率及剪切力對球形BC合成的影響。

圖1　不同轉速條件下產球形BC的形貌Fig.1 Morphology of sphere-like BC at different rotate speeds

由圖1可知，轉速80～200 r/min時，所產的BC顆粒均為實心光球，但大小數量有所變化。從表觀上可以看出，轉速為200 r/min時是細小的顆粒，中間由一根絲狀體串聯成串，有零星的球狀顆粒散落在外；隨著轉速的增加，供氧效率的提高，球形顆粒直徑呈明顯的減小趨勢，顆粒數逐漸增加，當轉速為80 r/min時顆粒數較少，單球直徑最大可達3 cm，而在50 r/min時為團塊狀BC。

2.1.2轉速對動態發酵產球形BC均勻度的影響

（1）轉速對BC總產量和不同大小球形BC質量百分比的影響

轉速升高，供氧效率升高，但BC產量逐步下降，其原因可能是溶解氧過高時菌體不斷分裂，能源物質主要被用于自身生長，而產纖維素的代謝途徑被抑制或是還未滿足某種代謝條件而未順利進行，甚至可能是由于菌體對剪切力敏感性較強，轉速的提高，剪切力變大，從而使菌體生長及生產穩定性變差且容易突變［17］。

圖2　轉速對BC總產量和不同大小球形BC質量百分比的影響Fig.2 Effect of rotate speed on total yield o f BC and qua lity percent of sphere-like BC w ith different sizes

由圖2可知，當供氧效率增高時，小球BC質量百分比隨之升高，在轉速＞170 r/min之后，所產球形BC均為直徑＜5 cm的小顆粒；與之相對的大球BC質量百分比在轉速80 r/min時達到最高值93.5%，而后隨供氧效率的增加快速減小，直至質量百分比為0。只有在轉速為130 r/min時，中球BC質量百分比達到最高40.29%，形貌均勻一致。其他轉速下所產中球BC質量百分比均＜40%。

（2）轉速對BC總產量和不同大小球形BC數量百分比的影響

由圖3可知，隨著轉速升高，供氧效率提高，大球BC數量百分比從最高75.00%降至0，小球BC數量百分比不斷增高，從0升高至100%，中球BC數量百分比由0先升高至48.96%而又后降至0，在轉速為130 r/min時，中球數量百分比達到最高為48.96%。

結果表明，轉速為130 r/min時，此時供氧量最為合適，均勻度最好，所產中球BC產量與數量百分比均達到最高值分別為40.29%與48.96%，符合均勻度設定標準，認為其均勻度較佳。因此，轉速為130 r/min時發酵培養為宜。

圖3　轉速對BC總產量和不同大小球形BC數量百分比的影響Fig.3 Effect of rotate speed on total yield of BC and quantity percent of sphere-like BC with different sizes

2.2液深對動態發酵產球形BC合成情況的影響

2.2.1液深對動態發酵產球形BC形貌的影響

培養基液體深度對動態合成球形BC情況的影響結果見圖4。由圖4可知，從表觀形貌發現，所產的球形BC均為實心球，但大小、數量及外觀變化較大。液深為1.00 cm時，供氧效率較高，為細小的顆粒，球形顆粒外還零星分布著小刺毛；隨著溶液深度的增加，供氧效率降低，球形顆粒變大，刺毛逐步減少，當液深達2.05 cm后，均為光滑的球形顆粒。顆粒數隨液體深度的增加呈先增加后減少的趨勢。

圖4　動態發酵時不同液深條件下產生的球形BC的形態Fig.4 Morphology of sphere-like BC in d ifferent liquid depth during dynam ic fermentation

2.2.2液深對動態發酵產球形BC均勻度的影響

（1）液深對BC總產量和不同大小球形BC質量百分比的影響

由圖5可知，隨著液深升高，BC產量在液深1.35 cm后，產量呈減小的趨勢，其原因是在同一發酵容器中，球形BC產量、形貌、大小及數量與液體深度有關，液體中的含氧量會隨著液深的增加而降低［18］，從而抑制了菌體的生長繁殖，產量降低。而在液深為1.00 cm時，供氧效率最高，但BC產量1.35 cm時較低，其可能是由于培養基量較少，營養不足，從而導致產量較低。當供氧效率下降時，小球BC質量百分比隨之下降，當液深達到3.45 cm以后，小球BC質量百分比均＜5%；與之相對的大球BC質量百分比隨著液深的增加占比不斷升高，大球BC質量百分比保持在80%以上。在液深為2.40 cm、2.75 cm時，中球BC質量百分比分別為40.96%、43.05%，質量百分比均達到40%以上，可認為其所產BC形貌均勻度較好。

圖5　液深對BC總產量和不同大小球形BC質量百分比的影響Fig.5 Effect of liquid depth on total yield of BC and quality percent of sphere-like BC with different sizes

（2）對BC總產量和不同大小球形BC數量百分比的影響

圖6　液深對BC總產量和不同大小球形BC數量百分比的影響Fig.6 Effect of liquid depth on total yield of BC and quantity percent of sphere-like BC w ith differen t sizes

由圖6可知，在液深為1.00～1.70 cm，供氧效率較高，此時所產均為小球，隨著供氧效率的降低，小球BC數量百分比由100%逐漸下降至8.06%，大球BC數量百分比由0逐漸上升至64.40%，而中球BC數量百分比先由0%增加至48.96%而后減少至27.54%，在液深為2.40～4.15 cm時，中球BC數量占比均超過40%。

結果表明，在液深為2.40～4.15 cm時，中球數量百分比均超過40%，但結合中球BC質量百分比發現，在液深3.10～4.15 cm時質量百分比低于40%，故確定在液深為2.40～2.75 cm時均勻度最佳。

2.3發酵容器直徑對動態發酵產球形BC合成情況的影響

2.3.1發酵容器直徑對動態發酵產球形BC形貌的影響

在不同發酵容器直徑下獲得一系列球形BC結果見圖7。

圖7　動態發酵時不同發酵容器直徑產生的球形BC的形態Fig.7 Morphology of sphere-like BC in different fermentation vessel diameter during dynam ic fe rm enta tion

由圖7可知，從形貌上觀察，所產的球形BC均為實心球，但大小、數量、外觀變化較大。液深一定時，發酵容器直徑越大，供氧效率越快，所產BC顆粒越小。隨著球形顆粒的變小，BC球數量逐步增加。

2.3.2發酵容器直徑對動態發酵產球形BC均勻度的影響（1）對BC總產量和不同大小球形BC質量百分比的影響

圖8　容器直徑對BC總產量和不同大小球形BC質量百分比的影響Fig.8 Effect of vesse l diam eter on BC total yield and quality percent of sphere-like BC w ith different sizes

由圖8可知，隨著發酵容器直徑的增加，表面積增大，氣液接觸面積變大，氧氣溶入液體培養基的速度也會越大，即其溶氧量也會越大［18］，此時小球BC質量百分比隨之上升，當杯身直徑達到9.0 cm后，均為小球BC，質量百分比達100%；而大球BC質量百分比隨著杯身直徑的增加而降低，直至質量百分比為0。在容器直徑為6.0 cm和6.8 cm時，中球BC質量百分比均超過40%，分別為41.29%和43.24%，所產BC均勻度較好。但BC產量隨發酵容器直徑呈減少的趨勢，其原因可能是發酵容器直徑的增加會帶來高剪切力，從而影響產量。

（2）對BC總產量和不同大小球形BC數量百分比的影響

圖9　容器直徑對BC總產量和不同大小球形BC數量百分比的影響Fig.9 Effect o f vessel d iam ete r on BC total yield and quantity percent of sphere-like BC w ith different sizes

由圖9可知，隨著容器直徑的增加，溶氧量增加，大球BC數量百分比逐漸降低，小球BC數量百分比不斷增加，中球BC數量百分比先增大后減小，在容器直徑為4.9～6.8 cm之間時，中球數量百分比均超過40%，在直徑為6.0 cm時，中球BC數量百分比達到最大值53.51%。

結果表明，根據不同直徑球形BC數量百分比，在容器直徑為4.9～6.8 cm時，中球占比較高，但容器直徑為4.9 cm時，其中球BC質量占比只有27.78%，故容器直徑在6.0 cm與6.8cm時，所產BC均勻度較好，但在6.0 cm時產量是6.8 cm的1.4倍，考慮到產量因素，在容器直徑為6.0 cm時最佳。

2.4最優條件下生產穩定性分析

在上述最優條件下（發酵容器直徑為6.0 cm，液深為2.40～2.75 cm，轉速為130 r/min時）重復3次實驗，表1結果表明椰凍駒形桿菌（Komagataeibacternataicola）Y19產量較為穩定，且中球BC質量與數量百分比均＞40%，均勻度較佳，故通過上述發酵條件的優化，能夠獲得較為穩定的生產。

表1　最優條件下生產穩定性分析Table 1 Ana lysis of production stability under the op timum conditions

3　討論

轉速提高、發酵液液深降低及發酵容器直徑增大，均可使動態發酵時的供氧效率與剪切力提高。供氧效率增高，會提高BC合成的效率及產量，但過高的剪切力又會影響BC產量，YANG H等［16］也發現提高試驗轉速，顆粒直徑減小同時顆粒表面的“刺突”狀纖維絲增多，使顆粒間相互連結。楊雪霞等［19］報道了發酵罐培養時，對比轉速較快的六葉平漿，采用轉速較低的框式槳進行發酵時，細菌纖維素的產量最高。朱宏陽等［20］以解淀粉芽孢桿菌2F-7為考察菌株，以三角瓶為發酵容器，裝液量從50/250 m L～100 m L/ 250 m L時，發現BC顆粒產率升高，且顆粒直徑逐漸增大，當裝液量為70 m L/250 m L顆粒均勻度最佳。因此需要尋找到剪切力與供氧效率之間平衡點［21］。

4　結論

通過本研究發現隨著供氧效率的增加，剪切力增大，大球BC質量及數量百分比降低，小球BC質量及數量百分比升高，中球BC數量及質量百分比呈先增高后降低的趨勢，故供氧效率與剪切力合適時，才能獲得合適大小的球形BC且產量較高。實驗以中球BC質量及數量百分比為評價指標，探索了轉速，液深及發酵容器直徑條件引起的供氧效率及剪切力變化對動態發酵產球形BC均勻度的影響，可以得出在轉速為130 r/min時，液深為2.40～2.75 cm，發酵容器直徑為6.0 cm時，中球BC質量與數量百分比均＞40%，能獲得形貌均勻一致、大小適中的球形BC。本實驗為動態發酵生產球形BC提供了參考，為進一步擴大生產奠定理論基礎。

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Culture conditions for the sphere-like bacterial cellulose by dynamic fermentation

ZHANG Cui，BI Jicai，CHEN Huamei，WANG Yanmei，LIU Sixin，LI Congfa*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570228，China）

Bacterial cellulose（BC），especially sphere-like BC，as an excellent new biological material had been w idely applied in various fields.At present，the BC produced by dynamic fermentation was mainly irregular crumb，star shaped and filiform，and the application scope was lim ited. Therefore，it is urgent to obtain sphere-like BC w ith high uniformity by controlling the production conditions.During the dynamic fermentation，using Komagataeibacter nataicola Y19 as production strains，quality and quantity percent of sphere-like BC w ith medium size as the investigation indexes，the effects of the changes of supplying oxygen efficiency and shear force caused by rotate speed，fermented liquid depth and fermentation vessel diameter on the synthesis law of sphere-like BC were discussed.The results showed that the particle size of sphere-like BC was decreased and the quantity of sphere-like BC was increased w ith increasing the supplying oxygen efficiency and shear force.In the conditions of fermentation vessel diameter 6.0 cm，fermented liquid depth 2.40-2.75 cm and rotation speed 130 r/m in，the quality and quantity percent of sphere-like BC w ith medium size was more than 40%，and the uniform ity was up to the high set.

sphere-like bacterial cellulose；morphology of sphere-like bacterial cellulose；dynamic fermentation

TQ920．1

0254-5071（2016）05-0037-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．008

2016-03-08

海南省自然科學基金項目資助（314048）；海口市熱帶農產品深加工重點實驗室項目（2013-45）

章翠（1990-），女，碩士研究生，研究方向為應用微生物技術。

李從發（1967-），男，教授，博士，研究方向為食品生物技術。