氮源對釀酒酵母GJ2008不同糖濃度甘蔗汁酒精分批發酵的影響

柯善恢，伍時華，張　健*，趙東玲，黃翠姬

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

氮源對釀酒酵母GJ2008不同糖濃度甘蔗汁酒精分批發酵的影響

柯善恢，伍時華，張健*，趙東玲，黃翠姬

（廣西科技大學生物與化學工程學院，廣西柳州545006）

研究了不同糖濃度下氮源對釀酒酵母GJ2008甘蔗汁酒精發酵的影響，旨在為高濃度甘蔗汁酒精發酵提供研究基礎。將2 g/L尿素加入150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L和350 g/L總糖質量濃度甘蔗汁培養基中，以對應糖濃度未添加氮源組為對照組，通過分析細胞生長、糖代謝和乙醇生成來探究氮源如何影響甘蔗汁酒精發酵。結果表明：與未添加氮源相比，氮源加快了發酵速度，發酵周期最高縮短為18 h，糖消耗速率和乙醇生成速率最大分別提高了55%和96%；使酒精發酵更徹底，總糖含量最高減少了40.42 g/L；增加了目的產物，乙醇含量最高提升了28.4%。說明氮源有效地促進了甘蔗汁酒精發酵，加強了酵母的無氧呼吸途徑。

氮源；釀酒酵母GJ2008；甘蔗汁酒精發酵；無氧呼吸途徑

甘蔗富含蔗糖、葡萄糖和果糖，價格低廉，被認為是生產燃料乙醇最理想的糖質原料。乙醇作為生物能源，是最清潔的石油替代能源之一［1-3］。甘蔗汁酒精發酵最終酒精度偏低，高濃度甘蔗汁酒精發酵的發酵效率也不高，氮源可以有效促進高濃度甘蔗汁酒精發酵，但氮源如何影響甘蔗汁酒精發酵尚不清楚。氮源是構成菌體物質和一些代謝產物必需的營養元素，缺氮會使酒精發酵遲緩變慢［4］，甚至導致酒精發酵途徑的不完整。添加氮源幾乎對發酵過程所有參數都會產生有利影響［5］。為了弄清氮源如何影響酒精發酵，國內外做了很多研究尤其是氮源對酵母生長的影響［6］。GUTIéRREZ A等［7-8］發現在不同氮源下的酵母細胞生長（細胞數）與發酵活力并沒有嚴格的相關性，但氮源可以提高最終發酵酒精度。BLOMQVIST J等［9］發現兼性厭氧酵母布魯塞爾德克酵母（Dekkera bruxellensis）在厭氧條件下酒精發酵必須補充氮源。

本試驗研究氮源對不同糖濃度甘蔗汁酒精發酵的影響，通過分析酵母細胞生長、糖代謝和乙醇生成，探討添加氮源和不添加氮源對不同糖濃度甘蔗汁酒精發酵的影響，為高濃度甘蔗汁酒精發酵提高研究基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

酒精酵母（Saccharomyces cerevisiae）GJ2008：廣西科技大學發酵工程研究所保藏。

1.1.2培養基

斜面活化培養基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH。

一級種子培養基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH。

二級種子培養基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH。

發酵培養基：將白糖加入至甘蔗汁中調節初始總糖質量濃度150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L，分為加氮源和不加氮源兩組，調節pH 4.5，裝液量為200 m L/500 m L錐形瓶中。

以上培養基均于115℃蒸汽滅菌20 m in。

1.1.3試劑

甘蔗汁：廣西露塘糖廠；乙醇（色譜純）：天津市科密歐化學試劑有限公司；尿素（分析純）：廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司；精制白糖：南京甘汁園糖業有限公司。

1.2儀器與設備

SGD-IV還原糖測定儀：山東省科學院生物研究所；GC7890Ⅱ氣相色譜儀（配置火焰離子檢測器（flame ionization detector，FID）檢測器和T2100P色譜工作站）：上海天美科學儀器有限公司；UPHW優普系列超純水機：上海優普實業有限公司；HWY-2112全溫度恒溫調速搖床柜：上海智城分析儀器制造有限公司；1110M IKRO22R臺式冷凍離心機：德國Hettich公司；DMB5Motic數碼顯微鏡：麥克奧迪實業集團有限公司；XB.K.25血球計數板：北京科達有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1發酵方法

將32℃活化培養1～2 d斜面種子轉接至一級種子培養基中，搖床120 r/min、32℃培養12 h后按10%（V/V）接種量轉接至二級種子培養基中，牛皮紙透氣膜封口，搖床120 r/min，32℃培養12 h后離心（4 000 r/min，10 min）棄上清，用無菌水將酵母泥振蕩均勻制成10倍濃縮菌懸液，備用。以10%（V/V）接種量將二級種子分別接入200 g/L、250 g/L和300 g/L發酵培養基中，將過濾除菌的尿素以0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L量加入三種濃度培養基中，此為確定尿素添加量的預實驗。確定尿素添加量后，將過濾除菌的尿素溶液加入至150 g/L、200 g/L、250 g/L、300 g/L、350 g/L發酵培養基中，以10%（V/V）接種量將二級種子接入培養基和與上述質量濃度相同未添加尿素的培養基中，未添加氮源的發酵培養基為對照組，裝液量為200 m L/500 m L，發酵條件同上。每組2個平行，實驗數據取平均值。

1.3.2分析方法

總糖的測定：使用還原糖測定儀測定。細胞數的出芽率的測定：采用血球板計數法。死亡存活率測定：美蘭法［10］。乙醇濃度測定：采用氣相色譜儀測定發酵過程中乙醇濃度，用面積外標法分析酒精濃度。氣相色譜條件：氮氣（N2）作為載氣，柱溫控制為80℃，氣化室溫度150℃，檢測器溫度150℃，總載氣流速為92 m L/min，分流比為45∶1；發酵最終乙醇濃度用蒸餾法測定。

1.3.3數據處理

運用Origin 9.0軟件對發酵數據處理并作圖，運用Graph Pad Prism 5繪制和計算曲線下面積，數據處理按蔣凱［14］所述方法。

2　結果與分析

2.1氮源添加量的確定

因有機氮源成分復雜所以選尿素作為無機氮源，不同尿素添加量甘蔗汁酒精發酵最終乙醇濃度見表1。由表1可知，不同總糖質量濃度（200 g/L、250 g/L和300 g/L）甘蔗汁在不同尿素添加量條件下，酒精發酵最終乙醇含量不同，當尿素質量濃度為2 g/L時，最終乙醇含量最高，分別為88.2 g/L、116.8 g/L和137.3 g/L。因此，尿素添加量確定為2 g/L。

表1　氮源添加量與最終乙醇含量的關系Table 1 Relationship between n itrogen source addition and alcohol concentration g/L

2.2氮源對酵母菌細胞生長的影響

不同總糖質量濃度的甘蔗汁酒精發酵過程中氮源對酵母細胞生長、出芽率和死亡率的影響，如圖1所示。由圖1可知，相同糖濃度的甘蔗汁酒精發酵添加氮源與不添加氮源組（對照組）細胞數之間差距不大，250 g/L、300 g/L和350 g/L總糖質量濃度氮源組的細胞數在12 h后會略高于對照組，說明添加尿素在高濃度甘蔗汁酒精發酵時能一定程度增加細胞數。100 g/L和150 g/L總糖質量濃度時氮源組出芽率都明顯高于其對照組，但隨著總糖質量濃度的增高氮源組和對照組之間的出芽率趨于相同，說明添加尿素在低糖質量濃度時能增加細胞增長速率，高糖質量濃度時這種優勢隨總糖質量濃度增高而減弱。隨著總糖質量濃度的升高，乙醇含量在增加（350 g/L總糖質量濃度除外），氮源組和對照組死亡率也明顯在增加，由此推測酵母死亡率很可能與酒精生成即無氧呼吸途徑有關。而對比250 g/L氮源組和對照組可知，氮源組與對照組最終乙醇含量相似，都屬于較高乙醇含量，高乙醇含量也會影響酵母細胞生長，但氮源組的酵母細胞死亡率比對照組高出131.7%，而且氮源組與對照組最大的區別是氮源組的發酵速率比對照組快很多，乙醇產率高出58.0%，所以酒精發酵強度即無氧呼吸作用強度很可能也是造成酵母的死亡率增高的因素之一，即酵母的無氧呼吸作用越強酵母的死亡率就越高。同一總糖質量濃度氮源組與對照組比，氮源組死亡率高于對照組，尤其發酵最徹底的300 g/L總糖質量濃度，氮源組死亡率是對照組的3倍多。BELL S J等［11］指出氮源與酒精發酵即無氧呼吸途徑密切相關，釀酒酵母缺氮會降低發酵性能和導致不完整的酒精發酵。VARONGSIRI K等［5］發現非釀酒酵母在缺氮情況下酒精發酵后期酵母能明顯生長且保持高存活率（對比釀酒酵母）。氮源組比對照組的無氧呼吸更劇烈（乙醇產率更高），更徹底（殘糖質量濃度更低），生成的乙醇更多（乙醇含量更高），可見氮源強化了酵母的無氧呼吸途徑，又因為死亡率與無氧呼吸強度有關，最終尿素的添加增加了死亡率。

圖1　甘蔗汁酒精發酵中氮源對酵母菌細胞生長的影響Fig.1 Effect of nitrogen source on yeasts cell growth in sugarcane juice alcoholic fermentation

2.3氮源對甘蔗汁酒精發酵糖代謝的影響

圖2　甘蔗汁酒精發酵中氮源對殘糖含量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on the residual sugar content in sugarcane juice alcoholic ferm entation

由圖2可知，150～350 g/L總糖質量濃度氮源組都比對照組糖消耗快，其中150 g/L總糖質量濃度氮源組在18 h即達到總糖最低值而對照組達到最小值時為24h，故發酵周期縮短了6 h；其他糖濃度的氮源組發酵周期也都縮短6 h以上，說明氮源能夠明顯縮短甘蔗汁酒精發酵周期。總殘糖曲線下面積（area under curve，AUC）可以整體的評價糖消耗的快慢［12］，總殘糖AUC越小說明糖消耗越快加快發酵過程［13-14］，氮源組總殘糖AUC都比對照組快（見表2），說明氮源加速了總糖的消耗，這與PRETORIUS I S等［4］的研究結果相似；MESSIAS M J等［15］也指出總糖質量濃度較高時，氮源的加入效果會更加明顯。150～250 g/L總糖質量濃度的氮源組和對照組之間最終殘糖基本相同，但300 g/L和350 g/L總糖質量濃度氮源組殘糖分別比對照組小40.42 g/L和35.82g/L，說明氮源在高總糖質量濃度甘蔗汁酒精發酵時能顯著提高糖的利用率。350 g/L超高糖質量濃度時，氮源組和對照組殘總糖比300 g/L總糖質量濃度的高，乙醇含量比300 g/L總糖質量濃度的低，說明酵母發酵能力已受到高總糖質量濃度強烈地抑制。

由圖3可知，無論總糖質量濃度高低，氮源組總糖消耗速率都高于對照組。發酵0～3 h，總糖消耗速率氮源組都比對照組大，其中150 g/L、200 g/L、250 g/L總糖消耗速率明顯高于300 g/L和350 g/L，說明總糖質量濃度對酵母發酵的抑制作用在300 g/L時已開始表現出來，但無論糖質量濃度高低尿素的添加都促進了糖代謝。發酵3～6 h，總糖消耗速率都有所升高，氮源組仍高于對照組。前6 h氮源組雖高于對照組，但相差并不大，氮源組總糖消耗速率表現出巨大優勢是在6 h后，6～12 h氮源組比對照組分別高出36%、43%、55%、55%和14%，12～18 h時，氮源組基本都比對照組高出30%左右，其中150 g/L總糖質量濃度的氮源組由于糖提前消耗完而低于對照組。發酵18 h后除了因糖消耗完發酵結束外，氮源組總糖消耗速率都高于對照組。說明氮源的加入使各發酵階段糖消耗速率加快，主要作用階段在6 h之后；GEMMA B等［16］指出加入氮源總會加快糖消耗速率，但對數期效果更為明顯。

圖3　甘蔗汁酒精發酵中氮源對總糖消耗速率的影響Fig.3 Effect of nitrogen source on total sugar consum ption rate in sugarcane juice alcoholic fermentation

圖4　甘蔗汁酒精發酵中氮源對比總糖消耗速率的影響Fig.4 Effect of nitrogen source on total sugar specific consum ption rates in sugarcane juice alcoholic ferm entation

比總糖消耗速率為總糖消耗速率與活細胞數之比，能夠準確地表示單位活細胞與糖消耗速率之間的關系［14］。由圖4可知，無論總糖質量濃度高低氮源組比總糖消耗速率基本都高于對照組，發酵0～3 h和3～6 h氮源組比總糖消耗速率基本高于對照組但不明顯，與總糖消耗速率相似，說明0～6 h階段氮源對單位活細胞的糖代謝能力提升有限，這是因為發酵初始階段，發酵液溶氧充足使酵母細胞伴有有氧呼吸途徑，而且甘蔗汁本身含有一定量氮，所含氮源對無氧途徑的促進作用不明顯，氮源組與對照組的差異化不明顯。表現明顯差異的是在6 h后，氮源組的比總糖消耗速率明顯高于對照組，說明尿素的添加使單位活細胞的糖代謝能力提高，氮源組的總糖消耗速率總高于對照組本質原因是氮源大大增強活細胞的酒精發酵即無氧呼吸途徑。

2.4氮源對甘蔗汁酒精發酵生成乙醇的影響

圖5　甘蔗汁酒精發酵中氮源對乙醇含量的影響Fig.5 Effect of nitrogen source on alcohol contents in sugarcane juice alcoholic fermentation

由圖5可知，150 g/L和200 g/L總糖質量濃度氮源組和對照組最終乙醇含量一樣，但氮源組都比對照組提前到達最高乙醇含量，250～350 g/L總糖質量濃度氮源組不僅比對照組提前達到最高乙醇含量而且最終乙醇含量分別比對照組提升了6.3 g/L、22.1 g/L和29.0 g/L（見表2）。說明氮源不僅加快了乙醇的生成而且還提高了乙醇的產量，在高糖質量濃度表現得尤為明顯。

圖6　甘蔗汁酒精發酵中氮源對乙醇生成速率的影響Fig.6 Effect of nitrogen source on alcohol producing rates in sugarcane juice alcoholic fermentation

由圖6所示，發酵0～6 h氮源組乙醇生成速率基本都比對照組高，發酵6～12 h氮源組乙醇生成速率遠大于對照組，分別高出對照組35%、47%、86%、94%和15%，這個時段也是各總糖質量濃度乙醇生成速率最大的階段，發酵18 h后有些氮源組因發酵提前結束而使得乙醇生成速率低于對照組，其余氮源組都高于對照組，總體趨勢與總糖消耗速率基本一致。說明氮源提高了乙醇的生成速率，在6 h后表現得尤為明顯。

圖7　甘蔗汁酒精發酵中氮源對比乙醇生成速率的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on alcohol specific producing rates in sugarcane juice alcoholic ferm entation

比乙醇生成速率能夠準確地表示單位活細胞與乙醇生成之間的關系［14］。由圖7可知，發酵0～6 h氮源組稍高于對照組，由于這個階段無氧呼吸途徑并不劇烈，氮源對酵母活細胞酒精發酵促進作用有限。6～12 h氮源組遠高于對照組，其中250 g/L氮源組的比乙醇生成速率最大4.44×10-11g/h，比對照組高42.9%，對照組單位活細胞的產乙醇生成速率遠遠低于氮源組。說明氮源的加入使單位活細胞的乙醇生成能力增強。

2.5氮源對甘蔗汁酒精發酵主要發酵參數的影響

不同總糖質量濃度甘蔗汁酒精發酵主要參數見表2。由表2可知，添加氮源幾乎對發酵過程所有參數都產生了有利影響，這與VARONGSIRI K等［5］的研究結果一致。在總糖質量濃度不高（150 g/L和200 g/L）時，氮源組比對照組的發酵周期縮短6 h，乙醇產率分別高32.9%和28.7%，氮源加快了酒精發酵即無氧呼吸途徑。250～350 g/L不僅縮短發酵周期和提高乙醇產率，還使乙醇含量分提高5.7%、19.5%和28.4%，總糖發酵效率分別提高了4.9%、14.4%和15.2%，也使殘總糖降低，提高了糖的利用率。

表2　不同糖濃度氮源組與對照組甘蔗汁酒精發酵主要參數Table 2 Major param eters of the n itrogen source groups and control group w ith different sugar concentration during thesugarcane juice alcoholic fermentation

3　結論

本實驗研究了氮源對酒精酵母GJ2008不同總糖質量濃度甘蔗汁酒精發酵的細胞生長、糖代謝和乙醇生成的影響。結果表明：氮源加速了酒精酵母GJ2008的酒精發酵即無氧呼吸途徑，糖消耗和乙醇生成都更快；氮源使酒精發酵更徹底，殘糖更少；氮源使酵母產生了更多的目的產物，乙醇含量更高。總之，氮源的添加有效地促進了酒精發酵，同時氮源的加入增強了酵母發酵能力也加速了酵母菌的死亡速率。氮源是構成菌體的重要營養物質，是蛋白質合成不可缺少的元素，氮源對酒精發酵的促進可能與丙酮酸脫羧酶和乙醇脫氫酶有關，也可能與糖酵解途徑一種或幾種酶有關，具體原因需要進一步研究。本研究探索氮源對甘蔗汁酒精發酵過程的影響，發現氮源對甘蔗汁酒精發酵有明顯促進作用，尤其在高總糖質量濃度表現得更明顯，旨在為高濃度甘蔗汁酒精發酵和補料發酵提供研究基礎。

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Effect of nitrogen source on sugarcane juice batch alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae GJ2008 w ith different sugar concentrations

KE Shanhui，WU Shihua，ZHANG Jian*，ZHAO Dongling，HUANG Cuiji
（School of Biological and Chem ical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China）

In order to provide research basis for alcoholic fermentation of high sugarcane juice concentration，the effects of nitrogen on sugarcane juice alcoholic fermentation by Saccharomyces cerevisiae GJ2008 w ith different sugar concentrations were researched.2 g/L carbamide was added into the sugarcane juice mediums with sugar concentration of 150 g/L，200 g/L，250 g/L，300 g/L and 350 g/L.Using the corresponding sugar concentration groups without nitrogen source as control group，the effects of nitrogen source on sugarcane juice alcoholic fermentation were investigated by analyzina cell grow th，glycometabolism and the alcohol generation.The results showed that compared with control group w ithout nitrogen source，the nitrogen source could speed up the fermentation，and the fermentation period was shortened and the shortest period was 18 h.The sugar consumption rate and alcohol generation rate were increased by 55%and 96%，respectively，which made alcoholic fermentation more thoroughly，and the total sugar content was decreased by the highest for 40.42 g/L.The aimed products were increased，and the alcohol concentration increased by 28.4%.The study indicated that nitrogen source effectively promoted the sugarcane juice alcoholic fermentation and strengthened the anaerobic respiration of yeast.

nitrogen source；Saccharomyces cerevisiae GJ2008；sugarcane juice alcoholic fermentation；anaerobic respiration

Q815

0254-5071（2016）05-0031-06

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．007

2016-03-05

廣西科技攻關項目（桂科攻0782003-2）；廣西高校科學技術研究項目（YB2014202）

柯善恢（1989-），男，碩士研究生，研究方向為微生物代謝控制發酵。

張健（1964-），男，講師，本科，研究方向為微生物發酵技術。