新疆哈族奶酪中產蛋白酶非發酵劑乳酸菌的篩選及其系統發育分析

杜紫萱，盧士玲，王曉雯，蘆文娟，魏玉霞，李寶坤*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

新疆哈族奶酪中產蛋白酶非發酵劑乳酸菌的篩選及其系統發育分析

杜紫萱，盧士玲，王曉雯，蘆文娟，魏玉霞，李寶坤*

（石河子大學食品學院，新疆石河子832000）

以采集10份新疆塔城地區哈薩克族牧民自制的奶酪為原料，用改良的ROGOSA和MRS兩種培養基對其分離純化，共篩選出43株菌種，其中球菌32株，桿菌11株。對篩選出的菌株進行產蛋白酶和菌株自溶能力測定，結合生理生化特性和16S rDNA序列同源分析和建立系統發育樹分析，對挑選出的10株優勢菌進行了菌株分子生物學鑒定，鑒定結果表明：菌株R6-6自溶度最高，為42.32%；而自溶度最低的菌株為R4-4，達到6.21%；菌株R2-2、R4-2、R4-7為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epiderm idis）；菌株R3-5、R10-6為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）；菌株R3-2為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；菌株R6-6為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）；菌株R9-5、R9-6為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。其中產蛋白酶的最優勢非發酵劑乳酸菌（NSLAB）菌株為乳酸片球菌（P. acidilactici）。

哈薩克族奶酪；非發酵劑乳酸菌；蛋白酶；鑒定

新疆少數民族素有食用奶酪的傳統習慣，并且新疆民族特色奶酪歷史悠久、制作講究、風味獨特，是少數民族人民必食的奶制品之一，酸奶疙瘩等自制的奶酪制品遍布牧民家中，有的牧民把自養奶牛所產牛奶的50%以上用于制作奶酪供長年食用［1］。新疆哈薩克族乳酪是一種獨具民族特色，集營養性、安全性于一體的風味食品，在營養學界享有“奶黃金”的稱號［2］。采用傳統發酵方式對奶酪進行制作，選用經過幾千年的世代相傳和自然選擇的優良的微生物制成，風味獨特。

非發酵劑乳酸菌（non-starter lactic acid bacteria，NSLAB）是奶酪微生物中的一種獨特的菌群，屬于奶酪外源微生物，存在于所有的天然奶酪中。關于NSLAB的種類，目前研究較為成熟的有嗜溫乳酸桿菌（Mesophilic lactobacilli）、片球菌（Pediococci）、腸球菌（Enterococci）及明串珠球菌（Leuconostoc）［3］四類，但在部分研究中，也有將微球菌（M icrococci）列入非發酵劑乳酸菌的報道［4-5］。近10年來，國外研究者對奶酪中的非發酵劑乳酸菌的組成、影響微生物生長的因素等方面進行了大量研究。但國內在這方面的研究報道較少［6］。蛋白酶是一種重要的工業用酶，其生產幾乎占酶制劑市場的65%以上［7］，廣泛運用于食品、藥物、皮革制備、蛋白水解和紡織工業等［8-9］。何捷等［10］在對新疆傳統酸奶中，利用透明圈法篩選出一株高產蛋白酶的乳酸菌，經生理生化試驗和16S rRNA序列比對鑒定為發酵乳桿菌，為我國發酵食品提供了新的乳酸菌資源。張咚咚等［11-12］則對產蛋白酶的乳酸菌進行研究，采用16S rRNA同源性分析對高產蛋白酶乳酸菌的篩選及鑒定。本實驗以哈薩克族普通農戶家庭的自制奶酪中非發酵劑乳酸菌為基礎，在厭氧條件下，對產蛋白酶的乳酸菌進行了篩選分離純化，并進行生理生化試驗及16S rDNA同源性比對，希望能將獲得的高產蛋白酶NSLAB菌株進行篩選并建立系統發育分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料

采自新疆塔城地區的10份不同的哈薩克族牧民家自制的傳統奶酪，樣品經采集后裝入無菌袋密封，封口后立即放入便攜式自制冰箱內，間隔一定時間更換冰袋保持在較低的溫度下帶回實驗室后，將樣品放入-4℃冰箱保存，及時對樣品進行分離培養。

1.1.2培養基

改良的ROGOSA培養基［13］：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、葡萄糖20 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、磷酸二氫鉀6 g/L、乙酸鈉2.5 g/L、硫酸鎂乙酸鈉0.58 g/L、硫酸錳乙酸鈉0.15 g/L、硫酸亞鐵0.03 g/L、吐溫-80 1 m L、瓊脂20 g/L、蒸餾水1 000 m L。

MRS培養基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏10 g/L、葡萄糖、吐溫80、磷酸氫二鉀2g/L、乙酸鈉5g/L、檸檬酸三銨2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.25 g/L、瓊脂20 g/L和蒸餾水1 000 m L。

蛋白酶測定采用改良MRS培養基：在MRS培養基的基礎上加入2%的脫脂乳粉。

以上培養基均在115℃條件下滅菌20 min。

1.1.3化學試劑

0.85%無菌生理鹽水、50×TAE緩沖液、無水乙醇（分析純）、丙三醇（分析純）、脫脂乳粉、細菌基因組總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒（離心柱型）、溶菌酶、MarkerⅠ、2×PCR M ixture、ddH2O：天根生化科技（北京）有限公司；GoldView：北京索萊寶科技有限公司。

1.2儀器與設備

5417R高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；TC-512PCR擴增儀：意大利Techne公司；DNP-9272電熱恒溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；MP-502B電子天平：上海精密科學儀器有限公司；Gel.Doc2000凝膠成像儀：美國Bio-Rad公司；W-CJ-1C無菌操作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；LD2X-50KB蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3實驗方法

1.3.1NSLAB的分離及純化

參照樊哲新等［13］對新疆酸駝乳NSLAB的篩選及鑒定方法，對純菌株進行革蘭氏染色，鏡檢觀察菌體形狀、大小等，同時進行接觸酶試驗，參照《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》將革蘭氏染色陽性、接觸酶陰性的菌株初步判定為NSLAB。純菌株用終濃度為50%的甘油保藏于-18℃冰箱備用。

1.3.2產蛋白酶NSLAB菌株的篩選

產蛋白酶NSLAB的篩選采用加入脫脂乳粉（2%）MRS培養基［14］。操作方法：經液體培養基增菌后，選擇適宜的稀釋菌液用移液槍接種于MRS+2%脫脂乳粉培養基平板上，接種量為10 μL，置于37℃生化恒溫培養箱中培養24 h，以菌落透明圈（水解圈）作為初篩依據。

1.3.3產蛋白酶NSLAB的自溶度的測定

將連續活化兩代的菌株，低溫離心（5 000 r/min、15 min、4℃），將收集到的菌體用磷酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.8）［15］洗滌2次，并重懸于磷酸鈉緩沖液中，30℃培養24 h后，分別測定培養初始和24 h的OD645nm值。自溶度的計算公式如下：

式中：A1為菌體初始懸浮液吸光度值；A2為菌體培養24 h吸光度值。

1.3.4產蛋白酶NSLAB生理生化試驗

參照參考文獻［16-17］，將菌株分別進行硝酸鹽還原試驗、運動性試驗、產氣試驗等。通過生理生化試驗根據結果初步鑒定菌株。

1.3.5產蛋白酶NSLAB菌株16S rDNA分析

（1）純菌株DNA的提取

按照細菌基因組總DNA提取試劑盒（離心柱型）說明書的操作要求提取NSLAB菌株的DNA：其中第二步添加了溶菌酶，37℃水浴30 min，目的是破壞NSLAB的細胞壁。

（2）在質量方面，因路橋施工過程中涉及很多隱蔽工序，這些工序的質量能否得到保證，關鍵在于按照設計要求與現行規范來完成所有工序，并在此基礎上落實三檢制，即班組內自檢、班組間互檢和交接檢查，把好質量大關，完成驗收并確認合格后，才能正式進入到下一道工序當中，經過逐層檢查與嚴格把關，保證工程整體質量[2]。

（2）16S rDNA片段的PCR擴增

對NSLAB 16S rDNA進行聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。PCR采用50 μL擴增體系：DNA稀釋液2μL，上游、下游引物各2μL，2×PCRM ixture 25μL，ddH2O 19 μL。

引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物為341F（5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3），下游引物為805R（5-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3）。

PCR反應條件：95℃預變性10 min，35個循環（95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。

PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果在凝膠成像儀中觀察。委托生工生物工程（上海）股份有限公司對PCR產物進行測序，測序結果通過美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）上的局部序列比對基本檢索工具（basic local alignment search tool，BLAST）程序進行序列同源性比對。

2　結果與分析

2.1NSLAB分離純化結果

2.1.1菌株形態特征

圖1　菌株菌落形態（a，b）及革蘭氏染色（c，d）Fig．1 Colony morphology（a，b）and gram staining（c，d）of strains

2.1.2產蛋白酶NSLAB菌株的篩選結果

由于菌株產蛋白酶后水解培養基中脫脂乳粉蛋白，使得原本不透明的培養基變透明。以菌落透明圈作為初篩依據，選取的每個樣品分離出來的菌進行產蛋白酶NSLAB菌株篩選，結果見表2，部分菌株菌落透明圈的產生情況見圖2。由表2中43株菌落透明的產生情況可以看出，有32株菌產蛋白酶，產蛋白酶達到74.4%。由圖2可知，菌株R3-2、R4-7、R7-1產蛋白酶周圍都有明顯水解圈，菌株R3-3則沒有水解圈的產生，說明菌株R3-3不產蛋白酶。選取產蛋白酶的32株菌進行NSLAB菌株復篩。

圖2　NSLAB水解脫脂乳產生透明圈Fig．2 Transparent circle of skim m ilk hydrolyzed by NSLAB

表2　NSLAB產蛋白酶水解圈情況Tab le 2 Situation of pro tease hyd rolysis circ le of NSLAB

NSLAB的自溶受很多因素影響，所謂的自溶即是在一定的條件下，細胞自身的類水解細胞壁肽聚糖的網絡結構，造成細胞裂解［18］。NSLAB快速自溶會帶來可觀的經濟效益，因為自溶可以使大量的胞內酶得以釋放，可以加速干酪的成熟過程，大大的縮短了干酪的成熟周期，可降低生產成本。但是在生產乳酸菌發酵劑時，要求大量、高活力發酵劑菌體的生物量積累，然而菌體細胞在增殖的過程中會發生自溶，因此很難使NSLAB的活菌數達到較高的水平。因此，NSLAB自溶的快慢直接關系到干酪成熟的速度及其品質［19-20］。選取產蛋白酶的32株菌進行自溶度測定，結果見圖3。

圖3　菌株培養24 h自溶度Fig.3 Autolysis rate of strains culturing for 24 h

由圖3可知，32株菌的自溶能力各不相同，存在個體差異，與其所在種屬并無太大的關系。其中菌株R6-6自溶度最高，為42.32%；而自溶度最低的菌株為R4-4，達到6.21%；其余菌株的自溶度均在此范圍內變化。表明32株菌均有一定自溶度，但是具有一定差異性。

2.1.3菌株綜合分析

通過分離純化、革蘭氏染色試驗、鏡檢分析和接觸酶試驗，菌株產蛋白酶能力及自溶度的測定，從10種樣品分離得到的43株菌中初步篩選出菌株R2-2、R3-2、R3-5、R4-2、R4-7、R5-2、R6-6、R9-5、R9-6、R10-6。這10株菌革蘭氏染色呈紫色，接觸酶為陰性，產蛋白酶能力強，自溶度高，是具有優良性狀的NSLAB。

2.2菌株生理生化試驗結果

將初步篩選出的10株具有優良性狀的NSLAB經生理生化試驗初步鑒定，結果見表3。由表3可知，10株菌中，葡萄球菌屬（Staphylococcus sp.）3株，其共同特點為可利用多種碳水化合物，硝酸鹽還原反應呈陽性等；乳桿菌屬（Lactobacillus sp.）3株，其共同特點為15℃能生長，但在45℃環境下生長非常緩慢，反應較弱，能發酵果糖和葡萄糖，幾乎不能利用阿拉伯糖，利用半乳糖能力相對較弱。片球菌屬（Pediococcus sp.）4株，其共同特點為無運動性，不產芽孢，不可發酵蔗糖、甘露醇，但可以利用果糖、阿拉伯糖、半乳糖等。

表3　菌株生理生化試驗結果Table 3 Results of physiological and biochem ical experiments of strains

2.3菌株16S rDNA分析結果

通過對10株菌株的16S rDNA序列的PCR擴增，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到清晰的特異性條帶，片段大小均在400～500 bp之間，電泳圖結果見圖4。

對10株NSLAB進行進一步分子學鑒定，通過擴增各菌株的16S rDNA基因序列，并與NCBI數據庫中的已知序列進行比對，選擇與其相似性最高的典型菌株，進行相似性分析，并使用Mega5.05軟件中的鄰接法（neighbor-joining，NJ），自展值（bootstrap）設為1 000構建系統發育樹，結果見圖5。

由圖5可知，菌株R5-2與Pediococcus lolii的同源性為99%，菌株R3-5、R10-6與乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）的同源性分別為99%、100%，因Pediococcus lolii在NCBI數據庫中屬于乳酸片球菌種（Pediococcus acidilactici），即將菌株R5-2、R3-5和R10-6共同鑒定為乳酸片球菌；菌株R3-2與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）同源性達到100%，即鑒定為無糖乳桿菌；菌株R6-6與干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）同源性為100%，即將其鑒定為干酪乳桿菌；菌株R9-5、R9-6與鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）同源性分別為100%、99%，故將其鑒定為鼠李糖乳桿菌；菌株R2-2、R4-2、R4-7與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的同源性均達到100%，即可鑒定為表皮葡萄球菌。ADDIS E等［21］在藍紋干酪中分離出了葡萄球菌和微球菌，發現接觸酶呈陰性的表皮葡萄球菌與微球菌之間的界限并不是很清晰，它們均表現出一定程度的蛋白質和脂肪水解能力，增強干酪風味。此外，伯杰手冊第七版中也將表皮葡萄球菌劃入了微球菌屬，本研究結果與之相符。

圖4　菌株16S rDNA的PCR擴增電泳圖Fig.4 16S rDNA PCR am p lification elec trophore togram of stra ins

圖5　基于16S rDNA序列的NSLAB系統發育樹Fig.5 Phy logenetic tree of the NSLAB based on 16S rDNA sequence

3　結論

以采集自新疆塔城地區的10份哈薩克族牧民自制的奶酪為原料，篩得非發酵劑乳酸菌43株，其中球菌32株，桿菌11株。并對菌株的產蛋白酶能力及其自溶度進行測定，結果表明，在43株菌中有32株菌在加入2%的脫脂乳粉培養基中產生透明的水解圈，說明菌株產蛋白酶水解了脫脂乳粉中的蛋白質，而產蛋白酶菌株達到74.4%；選取產蛋白酶的菌株測定自溶能力，而菌株自溶能力與其所在種屬并無太大的關系，存在個體差異，菌株R6-6自溶度最高，為42.32%；而自溶度最低的菌株為R4-4，達到6.21%；

最后，結合生理生化特性，利用16S rDNA序列同源分析和建立系統發育樹分析對挑選出的10株菌進行了分子鑒定，鑒定結果表明，菌株R2-2、R4-2、R4-7為表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）；菌株R3-5、R10-6為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）；菌株R3-2為戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）；菌株R6-6為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）；菌株R9-5、R9-6為鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）。

在對新疆塔城哈族牧民自制奶酪中篩得的菌株中，種類并不多，其中產蛋白酶的優勢NSLAB菌株為乳酸片球菌屬（P.acidilactici）。

［1］馬燕，倪永清，盧士玲，等.新疆特色干酪中乳酸菌的分離鑒定［J］.中國釀造，2011，30（8）：38-40.

［2］馬春燕，新華·那比，劉紅梅.哈薩克族傳統發酵乳酪中發酵菌的分離鑒定［J］.中國乳品工業，2010，38（4）：7-9，19.

［3］CASEY M G，H?NI J P，GRUSKOVNJAK J，et al.Characterisation of the non-starter lactic acid bacteria（NSLAB）of Gruyère PDO cheese［J］. Dairy Sci Tech，2006，86（9）：407-414.

［4］DALEVP G.Utilisation of waste feathets from pourtry slaughter for produetion of a protein coneentrate［J］.Bioresource Technol，1994，48（2）：265-267.

［5］吳非，張寒冰，劉曉玲.干酪加工中的牛奶內源酶和非發酵劑乳酸菌［J］.中國乳品工業，2006，34（8）：52-54.

［6］周蕊，李曉東，潘超.促熟干酪的非發酵劑乳酸菌篩選及其對干酪漿模型蛋白質降解的研究［J］.食品科學，2012，33（1）：131-135.

［7］RAO M B，TANKASALE A M，GHATGE M S，et al.Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases［J］.M icrobiol M ol Biol Rev，1998，62（3）：597-634.

［8］JOHNVESLY B，NAIK G R.Studies on production of thermostable alkaline protease from thermophilic and alkaliphilic［J］.Process Biochem，2001，37（2）：139-144.

［9］HAKI G D，RAKSHIT S K.Developments in industrially important thermostable enzymes：a review［J］.Bioresource Technol，2003，89（10）：17-34.

［10］何捷，曾小群，呂鳴春，等.新疆酸奶中高產蛋白酶與產脂肪酶乳酸菌的篩選［J］.食品科學，2015，36（17）：130-133.

［11］張咚咚，安家彥，姜鐵民，等.傳統發酵乳中高產蛋白酶乳酸菌的篩選及鑒定［J］.食品科技，2013，38（8）：5-8.

［12］陳超，高學軍，劉營，等.產蛋白酶乳酸菌的篩選及蛋白酶的純化［J］.乳業科學與技術，2008，11（4）：160-162.

［13］樊哲新，李寶坤，李開雄，等.新疆酸駝乳NSLAB的篩選及鑒定［J］.食品工業科技，2015，36（3）：170-174.

［14］徐建國，田呈瑞，胡青平，等.高產蛋白酶菌株的篩選及產酶條件優化［J］.中國糧油學報，2010，25（10）：112-115.

［15］方芳，冀林立，張彥斌，等.產耐熱蛋白酶乳酸菌的篩選、產酶條件及其酶學性質的研究［J］.食品科學，2008，29（10）：375-379.

［16］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

［17］凌代文.乳酸菌分類鑒定及實驗方法［M］.北京：中國輕工業出版社，1999.

［18］孫卓，呂加平，張佳程，等.乳酸菌自溶對切達干酪成熟中蛋白質分解的影響［J］.中國乳品工業，2010，38（12）：12-14，40.

［19］王秋宇，梁愛云，李曉東，等.非發酵劑乳酸菌的誘變選育及對干酪促熟的研究［J］.食品工業，2013（5）：63-66.

［20］崔文明，劉鷺，張書文，等.保加利亞乳桿菌LJJ自溶的影響因素分析［J］.食品與發酵工業，2013，39（7）：6-12.

［21］ADDIS E，FLEET G，COX J，et al.The grow th，properties and interactions of yeasts and bacteria associated w ith the maturation of Camembert and blue-veined cheeses［J］.Int J Food M icrobiol，2001，69（1）：25-36.

Screening of protease-producing non-starter lactic acid bacteria from Xinjiang Kazak cheese and its phylogenetic analysis

DU Zixuan，LU Shiling，WANG Xiaowen，LU Wenjuan，WEI Yuxia，LI Baokun*
（College of Food Science，Shihezi University，Shihezi 832000，China）

A total of 43 strains were screened from 10 pieces of the Kazak homemade cheese in Xinjiang Tacheng prefecture by improved ROGOSA and MRS medium，in which 32 strains were Coccus and 11 strains were Bacillus.The ability of protease-producing and autolysis of strains were determ ined.Combined w ith physiological and biochemical characteristics，16S rDNA sequence homology and phylogenetic tree analysis，the 10 dom inant strains selected were identified by molecular biology method.The results showed that the autolysis rate of strain R6-6 was the highest of 42.32%，and the autolysis rate of strain R4-4 was the lowest of 6.21%.Strain R2-2，R4-2 and R4-7 were identified as Staphylococcus epiderm idis，strain R3-5 and R10-6 were identified as Pediococcus acidilactici，strain R3-2 was indentified as Pediococcus pentosaceus，strain R6-6 was indentified as Lactobacillus casei，and strain R9-5 and R9-6 were identified as Lactobacillus rhamnosus，in which the non-starter lactic acid bacteria（NSLAB）with high protease-producing was identified as P.acidilactici.

Kazak cheese；non-starter lactic acid bacteria；protease；identification

Q939．97

0254-5071（2016）05-0020-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．005

2016-03-04

國家自然基金地區項目（31560444，31460007）；國家自然基金青年項目（31201395，31301523）；兵團博士基金專項（2014BB005）；石河子大學重大科技攻關項目（gxjs2014-zdgg07）；石河子大學高層次人才啟動項目（RCZX201223）

杜紫萱（1991-），女，碩士研究生，研究方向為畜產品加工與安全。

李寶坤（1979-），男，副教授，博士，研究方向為畜產品加工與質量安全。