miR-21對人喉鱗癌Hep2細(xì)胞增殖與凋亡的影響

曲　莉

(南陽市中心醫(yī)院耳鼻喉二病區(qū)，河南南陽 473000)

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miR-21對人喉鱗癌Hep2細(xì)胞增殖與凋亡的影響

曲莉

(南陽市中心醫(yī)院耳鼻喉二病區(qū)，河南南陽 473000)

目的探討miR-21對人喉鱗癌Hep2細(xì)胞增殖與凋亡的影響。方法脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將miR-21 inhibitor和miR-21陰性對照(NC)轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活力，克隆實(shí)驗(yàn)及Hoechst染色分別檢測細(xì)胞增殖與凋亡情況，Western blot檢測人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(PTEN)、程序化死亡蛋白4基因(PDCD4)、Bax、Bcl-2表達(dá)及蛋白激酶B(AKT)磷酸化水平。結(jié)果與miR-21 NC比較，miR-21 inhibitor能顯著抑制細(xì)胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018),P<0.01]，降低細(xì)胞克隆數(shù)目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86),P<0.01]，提高細(xì)胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%,P<0.01]，并上調(diào)PTEN、PDCD4、Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)及降低AKT磷酸化水平(P<0.01)。結(jié)論miR-21 inhibitor通過PTEN/AKT信號通路抑制人喉鱗癌Hep2細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡，并調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。

miR-21；人喉鱗癌Hep2細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

喉鱗癌是我國耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤，占耳鼻咽喉科腫瘤的36%左右，其中喉鱗狀細(xì)胞癌是其主要病理類型，占90%以上，手術(shù)治療、化學(xué)療法和放射治療是其主要治療方式，但對中晚期患者預(yù)后及5年生存率效果欠佳[1]。而喉鱗癌發(fā)病機(jī)制尚未清楚，吸煙、飲酒、病毒感染、環(huán)境污染、癌基因的激活及抑癌基因的失活都可能是其病因。miRNA是目前新發(fā)現(xiàn)的一類癌基因或抑癌基因，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為中起重要作用[2]。已通過miRNA芯片技術(shù)證實(shí)48對喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中4個(gè)miRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，包括miR-21[3]。也發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細(xì)胞癌患者血清中miR-21表達(dá)量顯著增高，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并能作為喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)記物及預(yù)后的獨(dú)立因子[4]。提示miR-21在喉鱗癌中過表達(dá)，并作為癌基因參與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究擬通過下調(diào)人喉鱗癌細(xì)胞中Hep2中miR-21的表達(dá)，探討其對Hep2細(xì)胞增殖及凋亡的影響，從而為喉鱗癌的診斷及預(yù)后判斷提供新的思路。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株人喉鱗癌細(xì)胞Hep2購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫，目錄號：TCHu21。

1.1.2主要試劑和儀器兔抗Bax，Bcl-2單克隆抗體(Epitmics公司，美國)；兔抗PDCD4、PTEN、AKT、p-AKT單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，美國)；miR-21 inhibitor及對照miR-21 NC(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；Hoechst 33258染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法(Gibco公司，美國)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)。迷你雙垂直電泳儀、迷你轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一儀器廠)；ChemiDocTMXRS凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國)。

1.2方法

1.2.1MTT法檢測Hela細(xì)胞活力將人喉鱗癌細(xì)胞Hep2接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor和miR-21陰性對照(negative control,NC)。48 h后，加入5 mg/mL MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 150 μL，震蕩使結(jié)晶物充分溶解，于酶標(biāo)儀560 nm處測OD值，以O(shè)D值表示細(xì)胞相對活力。

1.2.2集落形成實(shí)驗(yàn)將人喉鱗癌細(xì)胞Hep2接種于96孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor和miR-21 NC，48 h后，用含10%甲醛和0.1%結(jié)晶紫染液固定染色。輕輕甩去染色液，拍照分析。

1.2.3Hoechst染色將人喉鱗癌細(xì)胞Hep2接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor和miR-21 NC。48 h后消化收集細(xì)胞，后按照Hoechst 33258染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，4%多聚甲醛固定，Hoechst 33258染色液避光染色，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4Western blot將人喉鱗癌細(xì)胞Hep2接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%時(shí)，用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor和miR-21 NC。48 h后消化收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解，離心即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對蛋白濃度進(jìn)行測定。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜。一抗溶液孵育，4 ℃過夜；二抗溶液中室溫孵育。在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件對各抗體條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2　結(jié)　　果

2.1miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2活力的影響人喉鱗癌細(xì)胞Hep2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor和miR-21 NC 48 h后，經(jīng)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-21 inhibitor能顯著抑制細(xì)胞活力[(0.728±0.045)vs.(0.393±0.018)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2克隆形成及凋亡的影響miR-21 inhibitor能顯著減少Hep2細(xì)胞克隆數(shù)目[(158.38±14.47)vs.(65.52±6.86)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。miR-21 inhibitor亦能顯著提高Hep2細(xì)胞凋亡率[(8.45±0.67)%vs.(40.23±3.46)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

A：miR-21 NC；B：miR-21 inhibitor。

圖1miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2克隆形成能力的影響

A：miR-21 NC；B：miR-21 inhibitor。

圖2miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2凋亡的影響

2.3miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2中PDCD4、Bax及Bcl-2表達(dá)量的影響miR-21 inhibitor能顯著上調(diào)PDCD4及Bax表達(dá)(P<0.01)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)(P<0.01)，見圖3、表1。

2.4miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2中PTEN/AKT信號通路的影響miR-21 inhibitor能顯著上調(diào)PTEN表達(dá)(P<0.01)，降低AKT磷酸化水平(P<0.01)，見圖4、表2。

圖3　　　　　miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2中PDCD4、Bax及Bcl-2表達(dá)量的影響

項(xiàng)目Bcl-2BaxPDCD4miR-21NC1.143±0.0840.345±0.0731.296±0.089miR-21inhibitor0.367±0.027*1.012±0.025*0.379±0.063*

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

圖4　　　　　miR-21 inhibitor對人喉鱗癌細(xì)胞Hep2中PTEN/AKT信號通路的影響

項(xiàng)目PTENp-AKT/AKTmiR-21NC0.354±0.0260.612±0.062miR-21inhibitor1.043±0.079*0.342±0.035*

*：P<0.01，與miR-21 NC比較。

3　討　　論

miR-21是2001年Lagos-Quintana等在非脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中首次發(fā)現(xiàn)的，隨后在小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞及Hela細(xì)胞中陸續(xù)檢測到，已證實(shí)miR-21與喉癌、大腸癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其表達(dá)呈上調(diào)趨勢[2,5]。Cao等[3]通過miRNA芯片分析也證實(shí)48例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中4個(gè)miRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，包括miR-21。Wang等[4]檢測52例喉鱗狀細(xì)胞癌患者及52例聲帶息肉患者血清中miR-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)喉鱗狀細(xì)胞癌患者血清中miR-21表達(dá)量顯著增高，可作為喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)記物及預(yù)后的獨(dú)立因子。提示miR-21在喉鱗癌細(xì)胞中起致癌miRNA作用，并與喉鱗癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，miR-21反寡義核苷酸既能在體外顯著抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并能在體內(nèi)抑制SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長，促進(jìn)其凋亡[6-7]。miR-21 inhibitor亦對胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞具有增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用[8-10]。說明下調(diào)miR-21表達(dá)能顯著地影響多種腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，同時(shí)已報(bào)道PTEN、PDCD4、Bcl-2等多個(gè)蛋白是miR-21在不同腫瘤細(xì)胞中的靶基因，通過靶向調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡等行為[11]。所以本研究在此基礎(chǔ)上，探討miR-21是否通過調(diào)節(jié)相關(guān)靶蛋白的表達(dá)，從而影響喉鱗癌細(xì)胞Hep2的增殖與凋亡。

細(xì)胞的凋亡受細(xì)胞凋亡基因嚴(yán)格調(diào)控，其中研究最為廣泛的是Bcl-2家族，Bcl-2可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞的生長增殖并阻滯癌細(xì)胞凋亡，在喉鱗癌組織呈高表達(dá)[12]。Bax是Bcl-2家族成員，與Bcl-2形成二聚體，維持細(xì)胞增殖凋亡平衡，Bax在喉鱗癌組織中低表達(dá)，并參與喉癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控[13]。PDCD4是新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或阻滯細(xì)胞周期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，其在人乳腺癌、肺癌、腸癌、喉癌等腫瘤中低表達(dá)，甚至缺失，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[14-16]。因此上調(diào)Bax及PDCD4表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，能有效地促進(jìn)喉癌細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果表明，miR-21 inhibitor能顯著抑制Hep2細(xì)胞克隆，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)Bax及PDCD4的表達(dá)。

腫瘤的增殖與凋亡受眾多信號通路調(diào)控，PI3K/AKT信號通路就是其中一種，其具有抗凋亡通路之稱，能與多種人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，能通過下游多種靶蛋白表達(dá)，如Bcl-2、PDCD4等，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、凋亡、血管生成及侵襲等過程。PI3K/AKT上游蛋白PTEN是miR-21的下游靶基因，在眾多腫瘤中表達(dá)低下，缺失或突變。PTEN能將三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化為二磷酸脂酰肌醇(PIP2)，從而負(fù)調(diào)控PI3K/AKT信號通路，在細(xì)胞凋亡中起重要作用。已報(bào)道PI3K/AKT在喉鱗癌中異常激活[17]。下調(diào)miR-21的表達(dá)可通過PTEN/AKT信號通路抑制白血病K562細(xì)胞增殖及遷移[18]。推測miR-21也能通過PTEN/PI3K/AKT信號通路影響喉癌細(xì)胞增殖凋亡等生物學(xué)行為。因此，本研究通過Western blot檢測miR-21轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞中此信號通路蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，miR-21 inhibitor能顯著上調(diào)PTEN表達(dá)，降低AKT磷酸化水平，從而提示miR-21表達(dá)量下調(diào)后能通過PTEN/AKT信號通路抑制喉鱗癌細(xì)胞Hep2增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-21 inhibitor能顯著的誘導(dǎo)喉鱗癌細(xì)胞Hep2凋亡，并抑制其克隆形成，與下調(diào)Bcl-2表達(dá)、上調(diào)Bax及PDCD4表達(dá)有關(guān)，可能是通過PTEN/AKT信號通路實(shí)現(xiàn)。

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·經(jīng)驗(yàn)交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.034

曲莉(1980-)，碩士，主治醫(yī)生，主要從事耳鼻喉疾病的研究。

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1671-8348(2016)24-3411-03

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2016-05-24)