趨化因子CCL2在重度顱腦損傷患者中的表達*

劉　蘇，孫李穎，吳勤峰，孫　麗，沈光宇

(南通大學附屬醫院康復醫學科，江蘇南通 226001)

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趨化因子CCL2在重度顱腦損傷患者中的表達*

劉蘇，孫李穎，吳勤峰，孫麗，沈光宇△

(南通大學附屬醫院康復醫學科，江蘇南通 226001)

目的研究趨化因子CCL2在重度顱腦損傷(TBI)患者腦組織中的細胞定位及在腦組織和血液中的表達，探討其與損傷程度的關系。方法選取36例2014年3月至2015年3月住院的重度顱腦創傷(GCS≤8分),且行開顱手術患者為觀察組，觀察組根據入院時格拉斯哥昏迷評分(GCS)再分為重型TBI組(6～8分)及特重型TBI組(3～5分)。10例健康人為血液對照組，采用免疫熒光雙標法觀察重度TBI患者檢測CCL2在腦組織中的細胞定位，運用ELISA法檢測損傷后腦組織和血液中CCL2的表達。結果腦損傷患者腦組織內CCL2主要表達在星型膠質細胞，重度腦損傷患者腦組織中CCL2水平明顯增高，CCL2在血液中的水平于術后1 d達高峰，術后30 d仍高于對照組(59.15±3.44)pg/mL，與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。特重型TBI患者腦組織中CCL2(312.84±36.50)pg/mL表達量高，與重型TBI患者(197.94±10.51)pg/mL相比，差異有統計學意義(P<0.05)。結論重度TBI患者CCL2表達水平與損傷程度密切相關。

腦損傷；趨化因子CCL2；免疫熒光染色

人類的大腦易受損害而導致認知、行為等異常，創傷性顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是全球健康問題。TBI常見于年輕人，已成為致殘和致死的主要原因之一，幸存者常常遺留有多種功能損害，成為家庭和社會的巨大負擔[1-2]。TBI 后神經炎癥反應主要包括膠質細胞的激活增生和炎性介質的表達上調，無論在繼發性損傷的起始或發展階段都起到了重要的作用，是造成繼發性損傷的主要原因之一[3]。趨化因子是參與神經炎癥調節的重要物質之一，本研究旨在觀察在重度TBI患者趨化因子CCL2(chemokine C-C motif ligand 2)在腦組織中的細胞定位及在腦組織和血液中的表達變化，探討CCL2在TBI中的作用。

1　材料與方法

1.1材料選取2014年3月至2015年3月于南通大學附屬醫院因重度TBI住院行開顱手術患者為觀察組，共36例，其中，男27例，女9例，年齡25～64歲，平均年齡47歲。觀察組納入標準：(1)明確車禍、高空墜落等創傷史，通過CT或MRI明確診斷，均是當天入院行手術；(2)入院格拉斯哥昏迷評分(GCS)3～8分；(3)達到開顱手術指征，需清除血腫及碎裂腦組織；(4)無嚴重心、肺、肝、腎等重要臟器病變。觀察組腦組織樣本來自手術中吸除的碎裂腦組織；觀察組血液標本取自南通大學附屬醫院因重度TBI住院且行開顱手術患者，觀察組根據入院時GCS評分再分為重型TBI組(6～8分)及特重型TBI組(3～5分)。對照組血液來自同期在本院健康體檢者，共10例，男8例，女2例，年齡23～65歲，平均年齡46歲。以上臨床標本的獲取均經患者或其家屬同意，并通過南通大學附屬醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1免疫熒光雙標染色檢測CCL2的細胞定位將在4%多聚甲醛中固定的腦組織取出，分別在20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水，待組織塊沉底后取出組織塊連續冰凍切片，厚度為20 μm，于0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液溶液(PBS)中清洗，加入5%羊血清封閉液室溫孵育2 h，加入2.5%羊血清抗體稀釋液稀釋的一抗，4 ℃過夜。一抗如下：羊抗人CCL2(1∶50，Santa Cruz，美國)和小鼠抗人GFAP(1∶5 000，Merck Millipore，德國) 或小鼠抗人NeuN(1∶500，Merck Millipore，德國)或兔抗人OX-42(1∶200，Wako，日本)。然后用0.01 mol/L PBS清洗玻片后加入0.01 mol/L PBS稀釋的二抗，室溫下避光孵育2 h，二抗如下：Alexa Fluor 488-驢抗小鼠-IgG(1∶1 000，Invitrogen，美國)、Alexa Fluor 488-驢抗兔-IgG(1∶1 000，Invitrogen，美國)和Cy3-驢抗羊-IgG (1∶1 000，Invitrogen，美國)。再用0.01 mol/L PBS避光清洗后，避光條件下行組織切片裱片，待陰干后用熒光封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察，攝片。

1.2.2ELISA法檢測CCL2蛋白的表達提前將ELISA試劑盒(武漢博士德公司)放在室溫平衡30 min，直接加已用樣品稀釋液稀釋的樣本(血清按1∶2稀釋，即100 μL樣品稀釋液加100 μL血清；腦組織根據測得蛋白濃度，每孔加蛋白總量為100 μg 的樣品蛋白溶液，再用樣品稀釋液補足至100 μL)。嚴格按照ELISA試劑盒說明書的操作步驟，加入生物素抗人CXCL1抗體工作液、ABC工作液、TMB顯色液，最后用TMB終止液終止反應。用酶標儀測定各孔在450 nm波長下的OD值。根據標準品制備的標準曲線，計算各樣本CCL2蛋白濃度。

表1　　各組腦組織和血液中CCL2蛋白的表達變化(pg/mL)

a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與特重型TBI組比較。

2　結　　果

2.1重度腦損傷患者損傷腦組織 CCL2主要與星形膠質細胞的標記物 GFAP共存，與小膠質細胞的標記物OX-42及神經元的標記物NeuN沒有雙標，顯示CCL2主要表達在星形膠質細胞中，見圖1。

2.2腦組織和血液中CCL2蛋白的表達變化觀察組患者腦組織中CCL2水平最高，CCL2在血液中的水平于術后1 d達高峰，隨后逐漸下降，術后30 d仍高于對照組，與對照組相比差異均有統計學意義(P<0.05)。特重型TBI組患者CCL2在血液表達量高，與重型TBI組患者相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

a、d、g：TBI后的損傷腦組織CCL2免疫陽性細胞；b:GFAP免疫陽性的星形膠質細胞；c:CCL2和GFAP的疊加圖；e:OX-42免疫陽性的小膠質細胞；f:CCL2和OX-42的疊加圖；h:NeuN免疫陽性的神經元；i:CCL2和NeuN的疊加圖。

圖1腦組織CCL2主要表達在星型膠質細胞

3　討　　論

TBI后損傷區附近出現激活增生的星形膠質細胞和小膠質細胞，損傷程度越重，其增生越嚴重，在被激活的情況下，膠質細胞作為免疫反應細胞，釋放一些信號分子，參與對神經元功能的調節，趨化因子是膠質細胞釋放的重要信號分子[4-6]。趨化因子CCL2是最早發現并被廣泛研究的CC類趨化因子家族的成員之一，在生理情況下，CCL2主要由正常內皮細胞、成纖維細胞及單核細胞、白細胞等分泌，在一些腫瘤、炎癥等病變的組織細胞內也有表達[7]。CCL2 及其受體廣泛存在于神經系統中，是腦和脊髓創傷、神經退行性疾病、腦局部缺血、多發性硬化等多神經系統疾病重要的炎性介質之一[8-10]，CCL2 的生物學作用主要通過它的 G 蛋白耦聯受體 CCR2 而產生的[11]，CCL-2 也能和 CCR1、CCR4 等受體結合，但 CCR2 是 CCL2 優先結合的受體[12]。

本課題組在前期動物實驗研究中發現大鼠腦損傷后神經炎癥相關的趨化因子短期升高，在腦損傷后都有各自不同的表達趨勢，其腦損傷區皮層CCL2 表達在損傷后迅速增高，術后3 d達高峰，峰值高且維持時間長，且進一步研究發現CCL2 主要表達在星形膠質細胞，其受體CCR2 則主要表達在神經元，應用 CCR2 拮抗劑后發現腦損傷大鼠學習記憶能力改善的同時其皮層損傷區凋亡細胞也相應減少，提示 TBI 后 CCL2-CCR2 介導了激活的星形膠質細胞和神經元的相互作用，加重了繼發性損傷[13]。本研究發現重度腦損傷患者損傷腦組織中CCL2 主要表達在星形膠質細胞，部分表達在小膠質細胞中，提示激活的膠質細胞與CCL2的表達上升有關。重度腦損傷患者腦組組織中CCL2水平最高，CCL2在血液中的水平于術后1 d達高峰，術后30 d仍高于健康者，進一步研究發現與重型TBI患者相比，特重型TBI患者CCL2在人體內表達量高，損傷越重，CCL2在人體血液中的表達量越高，顯示CCL2的表達量可以反映腦損傷的嚴重程度。已有國外研究證實重度顱腦損傷患者損傷后腦脊液中CCL2迅速升高，損傷當日即達最高峰值，且持續表達較長一段時間[14-15]。

綜上所說，趨化因子CCL2在重度顱腦損傷患者的神經炎癥中發揮著重要的作用，提示也許在未來CCL2可以作為生物標記物用于判斷腦損傷的嚴重程度分級和預后，也有可能作為臨床治療的新靶點。

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·經驗交流·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.032

南通大學博士科研啟動基金項目(2016-2)。作者簡介：劉蘇(1977-)，博士，講師，主要從事神經康復的研究。△

，Tel:13862910918；E-mail:sgyrm@163.com。

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1671-8348(2016)24-3406-03

2016-02-15

2016-05-08)