神經元特異核蛋白單克隆抗體的構建*

王麗紅，張香娜，王楠楠，黃　錦，楊百萬，李　興，王光明

(1.大理大學臨床醫學院2012級臨床醫學，云南大理 671000；2.大理大學附屬醫院病理科，云南大理 671000)

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神經元特異核蛋白單克隆抗體的構建*

王麗紅1，張香娜1，王楠楠1，黃錦1，楊百萬1，李興1，王光明2△

(1.大理大學臨床醫學院2012級臨床醫學，云南大理 671000；2.大理大學附屬醫院病理科，云南大理 671000)

目的根據Pubmed報道的FOX3 cDNA序列，構建神經元特異核蛋白(Neun)單克隆抗體。方法獲得FOX3 cDNA序列，設計引物，PCR擴增，利用pcDNATM3.3-TOPO TA將純化后的PCR產物插入真核表達載體中，得到FOX3蛋白，然后利用該蛋白免疫小鼠，免疫后小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合，篩選后獲得的雜交瘤細胞小鼠腹腔接種，收獲腹腔積液后進行相關檢測。結果所獲得的腹腔積液經免疫印跡檢測，在(46～48)×103處顯示兩條帶，免疫熒光檢測后細胞核顯示陽性信號。結論根據FOX3 cDNA序列構建的抗體與商業化的抗Neun抗體在免疫熒光和免疫印跡上表現一致，Neun與FOX3為同一基因。

神經元特異核蛋白；FOX3；單克隆抗體

在1992年，Mullen等利用大鼠腦組織細胞核提取物免疫BALB/c小鼠，獲得對神經元特異的單克隆抗體：mAb A60，該抗體識別所有脊椎動物神經元特異的核蛋白，把該抗原命名為神經元特異核蛋白(neuron-specific nuclear protein，NeuN)，已廣泛用于神經科學、發育生物學和干細胞研究領域以及臨床病理診斷中[1]。

然而，目前市面上的Neun抗體僅僅是Mullen等利用嚙齒類動物腦組織蛋白提取物免疫動物獲得的，其應用僅僅局限于科研領域,并且Neun基因的cDNA序列無法獲得。2009年Kim等[2]研究發現認為NeuN屬于Fox-1基因家族，命名為Fox3。因此本研究在2014年1月至2015年5月根據FOX3的序列進行FOX3抗體的克隆，經研究證實，FOX3與Neun為同一個基因，因此達到Neun抗體的國產化，現報道如下。

1　材料與方法

1.1材料人腦組織來源于大理大學臨床醫學院司法鑒定中心進行尸檢的腦組織石蠟標本，材料使用獲得本校醫學倫理委員會和本院附屬醫院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1tRNA的提取和cDNA的合成，引物設計和PCR擴增

1.2.1.1腦組織cDNA合成切取8片5 μm石蠟包埋組織,按照EASYspin 石蠟包埋組織RNA快速提取試劑盒(艾德萊生物科技有限公司，中國)的說明書進行總RNA提取，按照cDNA合成試劑盒(Invitrogen公司，美國)的說明書進行cDNA的合成。

1.2.1.2FOX3引物設計根據pubmed上人FOX3的cDNA序列(NM_001082575.2)，用gene runner軟件設計引物，正義鏈：5′-ATG GCC CAG CCC TAC CCC CCC GCC CAG-3′；反義鏈：5′-TCA CAT GGT TCC AAT GCT GTA GGT CGC-3′。

1.2.1.3真核表達載體的構建依據如下條件進行PCR擴增，擴增試劑購自Invitrogen公司。起始變性95 ℃10 min，循環95 ℃10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸60 s，循環25次。PCR擴增后，PCR產物經OMEGA公司(美國)的Gel Extraction kit純化后，利用pcDNATM3.3-TOPO TA Cloning kit(Invitrogen公司，美國)將純化后的PCR產物插入真核表達載體中，所獲得的克隆經測序及電泳驗證準確的載體命名為pcDNA-FOX3。

1.2.2重組蛋白FOX3的獲得載體pcDNA-FOX3轉染293細胞(CRL-1573，北京鈞堯偉業生物科技有限公司)，有限稀釋，G418篩選，獲得單克隆。大量誘導表達生產，經過純化，得到蛋白抗原用于免疫小鼠。

1.2.3動物免疫及雜交瘤細胞的獲得

1.2.3.1動物免疫將成功獲得的FOX3抗原與氫氧化鋁佐劑制成的混懸液免疫鼠齡為8～12周的雌性BALB/c健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式，然后分離免疫后的小鼠脾臟細胞用于細胞融合。

1.2.3.2細胞融合和單抗篩選利用純化的FOX3抗原進行ELISA檢測，在3只小鼠中免疫反應最好的小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)進行融合，融合后的細胞經過適當稀釋，分置于96孔培養板中培養，待克隆生長到全孔的1/6時，標記單克隆及多克隆，培養10～14 d對單克隆進行ELISA檢測。ELISA檢測后將OD值最高的單克隆再有限稀釋接入96孔板中如上法所述再次亞克隆，此過程重復數次，直至陽性孔比率為100%，即認為此為陽性單克隆[3]。將篩選得到的陽性單克隆擴大培養，細胞數按(1～2)×106/管進行凍存。同時收集細胞用于腹水制備。

1.2.4腹腔積液制備和單克隆抗體檢測

1.2.4.1腹腔積液制備細胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹腔積液，細胞接種數量為5×106。接種10～14 d后收集腹腔積液。腹腔積液經Protein G柱純化處理，濃縮后檢測蛋白質濃度。

1.2.4.2免疫熒光染色小鼠的石蠟腦組織切片脫蠟到水后，0.3%甲醇雙氧水溶液(甲醇∶30%過氧化氫=9∶1)室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min。3次，然后用非免疫動物小鼠的血清1∶50稀釋，孵育30 min，加入接種了雜交瘤細胞小鼠的腹腔積液稀釋為0.1 ng/mL后，標本置于4 ℃過夜孵育，0.01 mol/L PBS洗滌5 min，3次，加入0.01 mol/L PBS稀釋的Alexa Fluor 594標記的二抗(Thermo Fisher Scientific，美國)按體積比1∶1 000，室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗滌5 min，3次，10%丙三醇封片，熒光顯微鏡觀察，染色結果與從美國Millipore公司(美國)購買的抗體“鼠抗人神經元特異核蛋白免疫組化單克隆抗體，MAB-0578”比較。

1.2.4.3免疫印跡檢測大鼠、小鼠和人的腦組織用蛋白質裂解液(包括封閉液，洗滌液等購自北京博奧森生物技術有限公司)裂解后離心，按美國Bio-Rad公司的蛋白濃度測定試劑盒和上樣緩沖液處理后SDS-PAGE電泳，轉膜后在搖床上用封閉液封閉30 min，接種了雜交瘤細胞小鼠的腹腔積液稀釋為0.04 ng/mL后4 ℃過夜孵育，洗滌液洗滌5 min，3次，加入抗體稀釋液稀釋的Alexa Fluor 594標記的二抗(1∶2 500)室溫搖床上孵育30 min，洗滌液洗滌5 min，3次，蛋白印跡檢測系統(ChemiDocMP，Bio-Rad公司，美國)檢測結果與MAB-0578比較。

2　結　　果

2.1基因克隆及抗體構建基本情況根據FOX3 cDNA序列設計的特異引物，經PCR擴增，凝膠電泳分析后可見1 200 bp左右的目的條帶，見圖1。PCR擴增得到的產物經膠回收試劑盒純化后插入pcDNATM 3.3-TOPO TA載體中進行克隆，轉化大腸桿菌后挑取15個克隆，分離質粒，送測序公司測序。測序結果與Pubmed上發表的FOX3 cDNA序列進行比對，得到1個克隆的序列與FOX3 cDNA序列完全一致，另外有兩個克隆的序列與FOX3 cDNA序列比對后，分別出現1個和2個無義突變，其余的12個克隆均出現突變。

用序列完全正確的克隆轉染293細胞，G418篩選后經PCR和免疫熒光檢測，能夠被Neun抗體識別的細胞克隆擴增后分離蛋白，然后用耦聯有Neun抗體的磁珠進行純化，洗脫后濃縮，得到的重組蛋白FOX3進行動物免疫。免疫動物的脾細胞與骨髓瘤細胞(SP2/0)融合后，進行篩選，得到了12個克隆；該12個克隆的細胞擴增后對雌性BALB/c健康小鼠進行腹腔接種，10～14 d后收集腹腔積液、純化、濃縮，得到的樣品用于后續的免疫熒光和免疫印跡。

M：Marker;S：樣本。

圖1FOX3全長cDNA PCR擴增

2.2免疫熒光檢測結果上述篩選得到的12個克隆經免疫熒光染色檢測，有兩個雜交瘤細胞克隆所產生的腹腔積液(含單克隆抗體)，其染色結果與MAB-0578完全一致，見圖2，均主要表現為細胞核陽性，其余克隆表現為細胞質陽性，稱為陰性克隆。

A：鼠抗人神經元特異核蛋白免疫組化單克隆抗體；B：陰性克隆，細胞質著色；C：陽性克隆，主要在細胞核著色。

圖2免疫熒光染色檢測結果(×200)

2.3免疫印跡檢測結果經免疫熒光篩選，可以識別大鼠、小鼠和人神經組織的神經元的產生腹腔積液的兩個雜交瘤細胞克隆，本研究選擇1個克隆對大鼠、小鼠和人神經組織提取物進行免疫印跡檢測，其結果與MAB-0578完全一致，見圖3。

A:構建的抗體為1抗；B:MAB-0578的抗體為1抗；M:Marker。

圖3腦組織蛋白提取物免疫印跡檢測

3　討　　論

mAb A60抗體可以識別所有脊椎動物神經元特異的核蛋白NeuN，已在神經科學、發育生物學和干細胞研究領域以及臨床病理診斷中得到廣泛應用[4-5]。但是由于該抗體是通過腦組織蛋白提取物免疫動物獲得的，因此無法得到該基因的核酸序列，使得依賴于基因核酸序列的相關研究受到一定的限制。

2009年Kim等[2]通過體外細胞實驗研究發現：Fox3陽性細胞表達的蛋白能夠完全被NeuN抗體識別，另外Fox3的siRNA轉染可以抑制NeuN在神經干細胞上的表達，從而認為NeuN屬于Fox-1基因家族，命名為Fox3，但是二者是否完全一致還有待探討[6]。雖然FOX3轉染和FOX3沉默均可以用Neun抗體進行檢測并得到了期望的結果，但是兩者之間還有可能為上下游關系，也就是說存在這樣的情況：基因FOX3的表達與否可以調控Neun的表達。因此為了確定FOX3和Neun為同一個基因，本研究以FOX3基因的cDNA序列為起點，經過一系列的分子生物學操作，構建FOX3抗體，然后與商業化的Neun抗體進行比較性研究。

抗體的構建包括單克隆抗體和多克隆抗體，但是前提必須能夠獲得抗原分子。在本研究中，由于Neun的基因序列未知，無法獲得Neun抗原分子，因此只能夠根據文獻報道[2]： NeuN屬于Fox-1基因家族，命名為Fox3，但是商品化的FOX3抗原仍然無法獲得，然而Fox3基因的序列可以從pubmed數據庫獲得，并且該cDNA序列預期編碼的蛋白質大小與Neun相似。因此，本研究通過分子生物學的方法，把Fox3 cDNA序列進行擴增，插入載體中，構建真核表達質粒，轉染細胞后經過篩選等，獲得了抗原，該抗原可以被Neun抗體識別。然后用FOX3重組蛋白免疫小鼠，得到可以產生FOX3抗體的脾細胞。為了保留脾細胞產生抗體的能力以及獲得無限增殖的能力，把脾細胞與骨髓瘤細胞進行融合，這樣獲得的雜交瘤細胞保留了產生抗體的能力和無限增殖的能力。經過一系列的篩選，初步篩選準確的雜交瘤細胞克隆腹腔接種后獲得腹腔積液。利用免疫熒光和免疫印跡檢測，本研究所構建的單克隆抗體與商品化的抗體一致。

Neun抗原主要分布在神經元的細胞核內，而在本研究構建的克隆中，免疫組化染色時部分克隆表達在細胞質內，認定為陰性克隆，只有在細胞核內表達的才確定為陽性克隆。陽性克隆在免疫印跡檢測中，與Mullen等的報道的結果一致：有(46～48)×103兩條帶，因此可以確定由FOX3基因的cDNA序列構建的抗體與商品化的Neun抗體為同一抗體，也就是說Neun與FOX3基因為同一基因?；騈eun(或者FOX3)在各種神經腫瘤中的表達特性預示著該抗體可以在病理診斷中發揮作用[6-8]，但是本研究構建的抗體經過一系列的檢測才能夠在臨床病理診斷中應用。另外，文獻介紹Neun在胚胎發育、干細胞分化、神經元的功能等方面具有重要作用[9-11]。通過本研究，確定了Neun基因與FOX3基因為同一個基因，為后續的研究提供了相關的信息。在引起神經元死亡的缺血性中風中，NeuN作為判斷神經元是否“健康”以及治療后療效檢測的指標[12]。對缺血90 min然后再灌流小鼠的研究中發現，短時間的灌流，在TTC染色還未能夠檢測到皮質損傷時，NeuN的表達就已經發生改變[13-14]。甲氟磷酸異己酯或氰戊菊酯(一種神經毒劑)暴露，神經元上NeuN的表達也發生改變[15]。因此需要通過大量的研究以闡明Neun在神經元的發育等方面的功能。

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Construction of the monoclonal antibody of neuron-specific nuclear protein*

WangLihong1,ZhangXiangna1,WangNannan1,HuangJin1,YangBaiwan1,LiXing1,WangGuangming2△

(1.Grade2012，ClinicalMedicineofClinicalCollege,DaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China；2.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofDaliUniversity,Dali,Yunnan671000,China)

ObjectiveTo construct the monoclonal antibody of anti-Neun basis on the sequence of FOX3 cDNA published on Pubmed.MethodsThe specific primers were designed basis on the sequence of FOX3 cDNA which was amplified with RT-PCR,then the PCR product was inserted into pcDNATM3.3-TOPO TA to get the eukaryotic expression vector FOX3.The splenocyte from mice which were immunized with the protein of FOX3 was merged with SP2/0 cell line to gain hybridoma cell.The hybridoma cell was transplanted into the abdominal cavity of mice and the abdominal dropsy through selecting was collected and used into immunofluorescence staining and immunoblotting.ResultsThere were two specific bands from (46-48)×103through immunoblotting and positive cells through immunofluorescence staining.ConclusionThe antibody anti-Neun from the FOX3 cDNA sequence was showed the same information from the commercialized Neun antibody,through checking with immunofluorescence staining and immunoblotting.The gene Neun was as same as to gene FOX3.

neuron-specific nuclear protein;FOX3;monoclonal antibody

·技術與方法·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.027

國家自然科學基金資助項目(81360206)；云南省中青年學術技術帶頭人后備人才基金(2014HB025)；云南省創新創業訓練計劃建設項目(S-CXCY-2014-6)；大理學院博士科研基金資助項目(KYBS201207)。作者簡介：王麗紅(1993-)，本科，主要從事神經生物學的研究?！?/p>

，Tel：18313159589；Email：gmwang1991@hotmail.com。

R737.3； R361.3

A

1671-8348(2016)24-3393-03

2016-02-17

2016-04-29)