脈血康膠囊對(duì)UUO大鼠腎組織STAT3和α-SMA表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究*

郭慶喜，蒲　霞，陳凱鋒，楊成萬(wàn)，曹　靈，孫興旺△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；2.中國(guó)人民解放軍42醫(yī)院病理科，四川樂(lè)山 614100；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000)

?

脈血康膠囊對(duì)UUO大鼠腎組織STAT3和α-SMA表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究*

郭慶喜1，蒲霞1，陳凱鋒2，楊成萬(wàn)1，曹靈3，孫興旺1△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川瀘州 646000；2.中國(guó)人民解放軍42醫(yī)院病理科，四川樂(lè)山 614100；3.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川瀘州 646000)

目的動(dòng)態(tài)觀察脈血康膠囊對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)大鼠腎組織信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(STAT3)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)的影響，探討脈血康膠囊對(duì)防治腎臟間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制。方法將96只SD雄性大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組、假手術(shù)組、模型對(duì)照組及脈血康組4個(gè)組，各24只，前3組給予生理鹽水灌胃，脈血康治療組術(shù)前3天開(kāi)始給予脈血康溶液灌胃。于造模后第1、4、7、14天每組隨機(jī)處死6只大鼠，動(dòng)態(tài)觀測(cè)腎組織形態(tài)學(xué)變化、纖維化情況及腎組織STAT3、α-SMA的表達(dá)。結(jié)果隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，模型對(duì)照組及脈血康組腎小管上皮變性、萎縮，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)增寬，以模型對(duì)照組最明顯。模型對(duì)照組和脈血康組腎小管上皮STAT3、α-SMA表達(dá)逐漸增高，與健康對(duì)照組及假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，脈血康組與模型對(duì)照組相比較，STAT3、α-SMA表達(dá)減少(P<0.05)。結(jié)論脈血康膠囊可能是通過(guò)Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，延緩UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

脈血康膠囊；腎間質(zhì)纖維化；上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis,RIF)是各種慢性腎病進(jìn)展到終末期的共同歸路，它是衡量慢性腎臟疾病進(jìn)展的重要病理指標(biāo)[1]。因而阻止或延緩小管間質(zhì)纖維化是阻止或逆轉(zhuǎn)進(jìn)行性腎功能惡化的關(guān)鍵。目前認(rèn)為RIF形成涉及細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)等多種因素，最終結(jié)局是大量ECM 的過(guò)度積聚[2]。腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MFB)是ECM產(chǎn)生的主要細(xì)胞[3]，腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化(epithelial-myofibroblast transdifferentiation,EMT)是MFB主要來(lái)源之一[4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)脈血康膠囊對(duì)慢性腎衰竭具有較好的療效[5]。本研究構(gòu)建大鼠單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型，檢測(cè)腎組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3,STAT-3) 的表達(dá)，探討脈血康膠囊對(duì)UUO大鼠RIF的防治作用及其可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物及試劑普通級(jí)雄性SD大鼠，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2008-1-7，使用許可證號(hào)：SYXK(川)2008-065，由瀘州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有大鼠飼養(yǎng)于專(zhuān)用的動(dòng)物房，每籠1只，并保持恒溫、通風(fēng)、安靜，每日更換墊料，定期消毒。脈血康膠囊購(gòu)于重慶時(shí)珍閣普生藥業(yè)有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z10970056)。兔抗鼠STAT3多克隆抗體、兔抗鼠α-SMA多克隆抗體購(gòu)于北京博奧森生物公司，多聚賴(lài)氨酸購(gòu)于深圳晶美公司，免疫組織化學(xué)即用型SP試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液購(gòu)于福州邁新生物公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物模型建立及分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成4組：健康對(duì)照組24只，假手術(shù)組24只，模型對(duì)照組24只，脈血康組24只。模型對(duì)照組和脈血康組造模方法：實(shí)驗(yàn)大鼠用2%戊巴比妥50 mg/kg腹腔注射，待麻醉效果滿(mǎn)意后，將大鼠固定于動(dòng)物手術(shù)臺(tái)上，術(shù)區(qū)剪毛，常規(guī)消毒、鋪巾，行下腹正中切口，在膀胱頸處分離出右側(cè)輸尿管，4號(hào)絲線(xiàn)結(jié)扎2次，制作大鼠UUO模型[6]。假手術(shù)組只做右側(cè)輸尿管游離但不結(jié)扎，健康對(duì)照組不做手術(shù)。健康對(duì)照組、假手術(shù)組及模型對(duì)照組于術(shù)前3 d起每日2 mL氯化鈉溶液灌胃。脈血康組手術(shù)前3 d及手術(shù)后每日給予脈血康0.05 g/kg，以2 mL 氯化鈉溶液稀釋灌胃。

1.2.2標(biāo)本采集分別于第1、4、7、14天各組隨機(jī)選取6只大鼠，用2%戊巴比妥0.5 mL腹腔注射麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，暴露心臟及雙腎，用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注固定腎組織，以沿腎周剝離腎包膜后，取右側(cè)腎臟對(duì)剖后置于4%多聚甲醛固定液中固定。

1.2.3蘇木精-伊紅(HE)形態(tài)觀察及結(jié)果評(píng)定腎組織經(jīng)脫水、透明、浸臘、包埋制成組織臘塊，常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察，每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)400倍視野，觀察腎小管-間質(zhì)的病理變化。腎小管-間質(zhì)病變由3個(gè)參數(shù)判定：腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死及小管擴(kuò)張程度；炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)程度；小管間質(zhì)纖維化的程度。每個(gè)參數(shù)按0～3分評(píng)定(0分判為正常；1分判為輕度受損，病變范圍小于15%；2分判為中度受損，病變范圍15%～50%；3分判為重度受損，病變范圍超過(guò)50%)，計(jì)算其均值，作為該例腎小管-間質(zhì)損傷指數(shù)[6]。

1.2.4免疫組織化學(xué)及結(jié)果評(píng)定常規(guī)切片，厚度3 μm，烤干備用。免疫組織化學(xué)采用SABC法，按照試劑盒說(shuō)明行STAT3、α-SMA免疫組織化學(xué)染色。同時(shí)以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。采用Image-pro plus病理彩色圖像分析處理系統(tǒng)進(jìn)行分析，通過(guò)光學(xué)顯微鏡攝取圖像，對(duì)圖像進(jìn)行灰度轉(zhuǎn)換，使陽(yáng)性面積與背景分開(kāi)，進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量。每例切片隨機(jī)觀察20個(gè)不重疊的400倍視野，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)部位染色面積總和與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎血管、腎小球及腎小管管腔面積)，以?xún)烧弑戎档钠骄颠M(jìn)行比較[7]。

2　結(jié)　　果

2.1腎組織形態(tài)學(xué)改變健康對(duì)照組、假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)腎臟大小、形態(tài)正常，組織結(jié)構(gòu)清楚。模型對(duì)照組術(shù)后第4天開(kāi)始腎體積增大，腎小管上皮腫脹，腎間質(zhì)疏松水腫，部分腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎小管擴(kuò)張，腎小管間隙增寬，纖維組織增生伴炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。脈血康組術(shù)后第7天開(kāi)始出現(xiàn)早期纖維化的病理改變，腎小管損傷、間質(zhì)纖維化程度較模型對(duì)照組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表1。

2.2腎小管上皮α-SMA動(dòng)態(tài)表達(dá)健康對(duì)照組及假手術(shù)組大鼠腎小管上皮幾乎不表達(dá)α-SMA。模型對(duì)照組及脈血康組各時(shí)間點(diǎn)腎小管上皮細(xì)胞見(jiàn)α-SMA表達(dá)，與前兩組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)呈逐漸上升趨勢(shì)。與模型對(duì)照組比較，脈血康組α-SMA表達(dá)減少，第14天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.018)，見(jiàn)圖2、表2。

2.3腎小管上皮STAT3動(dòng)態(tài)表達(dá)STAT3在健康對(duì)照組及假手術(shù)組表達(dá)極少，模型對(duì)照組及脈血康組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均較前兩組強(qiáng)(P<0.01)，且隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸上升；與模型對(duì)照組相比，脈血康組STAT3于第4、7、14天降低明顯(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

A:健康對(duì)照組；B:模型對(duì)照組；C:脈血康組。

圖1　　各組大鼠第14天腎組織形態(tài)學(xué)觀察(HE×200)

a：P<0.01，與健康對(duì)照組比較；b：P<0.01，與假手術(shù)組相比較；c：P<0.05，與模型對(duì)照組相比較。

A:健康對(duì)照組；B:模型對(duì)照組；C:脈血康組。

圖2　　各組大鼠腎第14天小管上皮α-SMA的表達(dá)(SABC×200)

a：P<0.01，與健康對(duì)照組比較；b：P<0.01，與假手術(shù)組比較；c：P<0.05，與模型對(duì)照組比較。

A:健康對(duì)照組；B:模型對(duì)照組；C:脈血康組。

圖3　　各組大鼠第14天腎小管上皮STAT3的表達(dá)(SABC×200)

a：P<0.01，與健康對(duì)照組比較；b：P<0.01，與假手術(shù)組比較；c：P<0.05，與模型對(duì)照組比較。

3　討　　論

脈血康膠囊主要成分是含有生物活性的水蛭素，水蛭素是存在于水蛭唾液中的一種酸性多肽類(lèi)物質(zhì)，具有抗凝與抗血栓形成，降低血壓和血脂，改善血流動(dòng)力學(xué)和微循環(huán)等作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，脈血康膠囊可以改善腎臟血液循環(huán)，減少蛋白尿?qū)δI臟起到保護(hù)的作用[9]。臨床應(yīng)用脈血康膠囊聯(lián)合愛(ài)西特治療慢性腎衰竭患者具有一定的療效，但作用機(jī)制不清楚，本研究通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)選定最佳劑量脈血康膠囊治療UUO模型大鼠，研究脈血康膠囊延緩腎間質(zhì)纖維化的可能機(jī)制。

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟病發(fā)展到慢性腎衰竭的共同病理特征，多種調(diào)節(jié)因子通過(guò)多種途徑最終引起細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)多沉積及成纖維細(xì)胞過(guò)度增生。Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)/STAT 信號(hào)通路廣泛參與細(xì)胞的活化、增殖、分化、凋亡及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程[10-12]。在JAK/STAT信號(hào)途徑中，STAT3是JAKs的下游底物[13]，其作用非常廣泛，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的信號(hào)向細(xì)胞核傳導(dǎo)，影響靶基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞功能。研究發(fā)現(xiàn)在腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制中，多種因子可通過(guò)激活JAK/STAT信號(hào)途徑發(fā)揮作用[14]，JAK/STAT通路的激活可促使腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，上調(diào)Ⅰ型膠原的表達(dá)，促進(jìn)纖維連接蛋白的合成，增加促纖維化因子的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的表達(dá)，從而促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生、發(fā)展[15]。Nightingale等[16]發(fā)現(xiàn)，腫瘤抑素M(OSM)可以通過(guò)STAT1、STAT3的磷酸化而激活JAK/STAT通路，從而促使腎小管上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。α-SMA是腎間質(zhì)纖維化肌成纖維細(xì)胞的一種特異性標(biāo)志蛋白，是腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)的標(biāo)志。

本實(shí)驗(yàn)在UUO大鼠模型中觀察到隨著梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，模型對(duì)照組大鼠腎臟出現(xiàn)體積逐漸增大，腎小管上皮變性、萎縮，腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)增寬，纖維組織增生伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)等表現(xiàn)，脈血康組術(shù)后第7天開(kāi)始出現(xiàn)早期纖維化的病理改變，但腎小管損傷、間質(zhì)纖維化程度較模型對(duì)照組輕(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示較健康對(duì)照組及假手術(shù)組，模型對(duì)照組及脈血康組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)α-SMA表達(dá)增加明顯(P<0.01)，且隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)增高。與模型對(duì)照組相比，脈血康組α-SMA表達(dá)減少，第14天差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明UUO可以成功建立腎間質(zhì)纖維化模型，導(dǎo)致腎小管上皮發(fā)生EMT，而脈血康膠囊可以調(diào)節(jié)腎小管EMT，減輕腎間質(zhì)纖維化程度。同時(shí)實(shí)驗(yàn)觀察到，JAK/STAT 信號(hào)通路因子STAT3在模型對(duì)照組及脈血康組各時(shí)間點(diǎn)表達(dá)均較健康對(duì)照組及假手術(shù)組明顯增高(P<0.01)，且隨梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)逐漸上升。運(yùn)用脈血康治療后，STAT3表達(dá)減少，第4天開(kāi)始減少明顯(P<0.05)。由此可見(jiàn)，脈血康能降低STAT3的表達(dá)，調(diào)節(jié)腎小管上皮EMT，從而減少肌成纖維細(xì)胞生成及ECM的堆積，延緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

[1]Negri AL.Prevention of progressive fibrosis in chronic renal diseases:antifibrotic agents[J].J Nephrol,2004,17(4):496-503.

[2]Liu Y.Hepatocyte growth factor in kidney fibrosis:therapeutic potential and mechanism of action[J].Am J Physiol Renal Physiol,2004,287(1):7-16.

[3]Meran S,Steadman R.Fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis [J].Int J Exp Path,2011,92(3):158-167.

[4]Kalluri R,Neilson EG.Epithelial-mesenchymal transition and its implications for fibrosis [J].J Clin Invest,2003,112(12):1776-1784.

[5]鄒德平,許志忠,朱再志,等.脈血康聯(lián)合愛(ài)西特治療慢性腎功能衰竭療效觀察[J]．醫(yī)學(xué)信息(上旬刊),2011,24(1):90-91．

[6]薛痕,樊均明,陳亮,等．大鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究[J]．四川動(dòng)物,2004,23(1)：16-20．

[7]張翠薇,謝茂,張旭,等.威靈仙對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻模型大鼠血液流變學(xué)及腎間質(zhì)纖維化的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(18)：3022-3024．

[8]嚴(yán)永興，梁麗貞，沈詠慧，等.脈血康膠囊對(duì)腦梗死恢復(fù)期患者療效及對(duì)凝血功能的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2012,37(23):3667-3668.

[9]朱俊江.疏血通治療2型糖尿病腎病的療效觀察[J]．臨床合理用藥雜志,2012,5(12)：75-76．

[10]Misseri R,Rink RC,Meldurm DR,et al.Inflammatory mediators and growth factors in obstructive renal injury[J].J Surg Res,2004,119(2):149-159.

[11]Jatiani SS,Baker SJ,Silverman LR,et al.JAK/STAT pathways in cytokine signaling and myeloproliferative disorders:Approaches for targeted therapies[J].Genes Cancer,2010,1(10):979-993.

[12]Fossett N.Signal transduction pathways,intrinsic regulators,and the control of cell fate choice[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(2):2375-2384.

[13]Swiatek Machado K,Kaminska B.STAT signaling in glioma cells[J].Adv Exp Med Biol,2013,986:189-208.

[14]Huang JS,Guh JY,Chen HC,et al.Role of receptor for advanced glycation end-product(RAGE) and the JAK/STAT-signaling pathway in AGE-induced collagen production in NRK-49F cells[J].J Cell Biochem,2001,81(1):102-113.

[15]Nakajima H,Takenaka M,Kaimori JY,et a1.Activation of the signal transducer and activator of transcription signaling pathway in renal proximal tubular cells by albumin[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(2):276-285.

[16]Nightingale J,Patel S,Suzuki N,et al.Oncostatin M,a cytokine released by activated mononuclear cells,induces epithelial cell-myofibroblast transdifferentiation via Jak/Stat pathway activation[J].J Am Soc Nephrol,2004,15(1):21-32.

Dynamic observation of Maixuekang capsule on the expression of STAT3 and α-SMA in rats with unilateral ureteral obstruction*

GuoQingxi1,PuXia1,ChenKaifeng2,YangChengwan1,CaoLing3,SunXingwang1△

(1.DepartmentofPathology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.DepartmentofPathology,No.42HospitalofPeople′sLiberationArmy,Leshan,Sichuan614100,China; 3.DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan,646000,China)

ObjectiveTo study the effect of Maixuekang capsule on the expression of signal transducer and activator of transcription-3(STAT-3) and α-smooth muscle actin(α-SMA) in the occlusion kidney dynamically by unilateral ureteral obstruction(UUO) in rats,and to investigate the effect and the mechanism of Maixuekang capsule on the renal interstitial fibrosis(RIF).MethodsNinety-six male sprague dawley(SD) rats were randomly divided into normal control group,sham-surgery group,model control group and Maixuekang group,with 24 rats in each group.The rats were given Maixuekang by gavage once a day started 3 days prior to operation,normal control group,sham-surgery group and model control group were given normal saline (NS)．Rats were sacrificed at the 1th，4th，7th and 14th day after operation．The levels of expression of STAT3、α-SMA and renal histopathology at each time point were examined in each group．ResultsIt′s significance of renal change including renal tubular epithelial degeneration and atrophy,renal tubular expansion and renal interstitial thickening of wide in model control group and Maixuekang group with the extension of obstruction time,especially in model control group.The expressions of STAT3 and α-SMA were increased in model control group and Maixuekang group,compared with normal control group and sam-surgery group(P<0.01).Compared with model control group,the expressions of STAT3 and α-SMA in Maixuekang group were decreased(P<0.05).ConclusionMaixuekang capsule may regulate the epithelial-myofiberoblast transdifferentiation of renal tubular epithelium through the JAK/STAT signaling pathway to postpone the proceeding of RIF.

Maixuekang capsule;renal interstitial fibrosis;epithelial-myofibroblast transdifferentiation;signal transducer and activator of transcription-3;α-smooth muscle actin

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.004

四川省科技廳重點(diǎn)項(xiàng)目(2010JY0080);四川省教育廳一般項(xiàng)目(11ZB226)。作者簡(jiǎn)介：郭慶喜(1977-)，碩士，副教授，主要從事分子病理方面的研究?！?/p>

，Tel：13508035625；E-mail：lzsunxw@163.com。

R692.3+3；R285.5

A

1671-8348(2016)24-3323-04

2016-02-04

2016-06-28)