CD151促進Rac/cdc42信號通路激活并維持體外血管生成的穩定性*

劉　濤,李鵬程,劉照宇,劉正湘,左后娟△

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院心血管內科，武漢 430000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心血管內科，武漢 430000)

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CD151促進Rac/cdc42信號通路激活并維持體外血管生成的穩定性*

劉濤1,李鵬程2,劉照宇2,劉正湘2,左后娟2△

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬普愛醫院心血管內科，武漢 430000；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心血管內科，武漢 430000)

目的探討CD151及其QRD突變體對Rac/cdc42信號通路和體外血管生成的穩定性影響及機制。方法脂質體介導質粒(pAAV-CD151、pAAV-CD151-QRD、pAAV-anti-CD151)轉染人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)，將HUVECs細胞分為對照組、CD151組、CD151-QRD組，anti-CD151 4組，分別取各個不同時間點評價Matrigel上的各組管腔血管形成能力及新生血管的穩定性。Western blot法檢測各組CD151蛋白表達，以及Rac和cdc 42信號通路蛋白表達。結果CD151組內皮細胞CD151表達(1.86 ±0.15)明顯高于對照組(0.90 ±0.06)，差異有統計學意義(P<0.01)；CD151-QRD組(1.75 ±0.16)與CD151組相比CD151蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，但anti-CD151組蛋白表達(0.51 ±0.06)明顯下降。在12 h Matrigel上CD151及其他各組之間血管生成比較差異無統計學意義(P>0.05)。36 h時，各組血管生成有區別。72 h，CD151組Matrigel上血管生成明顯高于其他各組，其他各組生成的血管不能維持。CD151高表達促進cdc 42,Rac蛋白表達增加，CD151-QRD組、 anti-CD151組蛋白表達則較CD151組下降。結論CD151促進Rac和cdc 42信號通路激活，促進體外血管生成并可維持生成血管的穩定性。

CD151;臍靜脈；內皮細胞;血管生成;血管穩定性

CD151是四跨膜蛋白超家族重要的成員之一，與整合素的作用關系最為密切[1-5]。血管形成的過程中，內皮細胞發生極化，細胞間接觸形成，CD151定位在極化內皮基底膜的外側[6-7]。CD151在血管生成中有重要作用，其是否通過與整合素結合調節內皮細胞黏附影響血管的新生，以及維持新生血管穩定性的機制并不清楚。CD151-QRD 是整合素結合缺陷的CD151突變體，將破壞CD151與整合素的結合，本研究通過Matrigel 上的管腔形成實驗評價各組血管形成能力及新生血管的穩定性維持的差異。Rac和cdc 42是血管生成過程中調節內皮細胞增殖、遷移，促進細胞間黏附的主要信號轉導分子[8]，本研究將進一步探討CD151促進血管形成及新生血管穩定性的相關分子機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和細胞株pZeoSV-CD151質粒由美國Oklahoma大學張欣教授提供。pAAV-CD151-QRD突變體采用定點突變法構建，pAAV-anti-CD151質粒構建采用反義核苷酸技術將CD151基因反向插入載體；已通過測序證實目的質粒的構建。人臍靜脈內皮細胞株(HUVECs)購自武漢大學。

1.1.2主要試劑瓊脂糖(agarose)、胰蛋白酶(Trypsin)、溴乙啶、改良Eagle培養基(DMEM)、二甲基亞砜購自美國Sigma公司。Matrigel、Fugene-HD轉染試劑購自美國BD公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。鼠抗人CD151抗體(5C-11)由美國oklahoma大學張欣教授提供，Rac抗體、cdc42抗體、β-actin抗體購自美國SantaCruz公司。化學發光試劑購自美國Pirce公司。PVDF膜購自美國Life Science公司。

1.1.3儀器超低溫冰箱(Revco公司，美國)、JA1003 型電子天平(武漢醫用儀器公司)、HQ-45 型恒溫搖床(中科院武漢科學儀器廠)、DKZ-2 電熱恒溫震蕩水槽(上海醫用電子儀器廠)、臺式高速低溫離心機(Beckman 公司，美國)、微量紫外分光光度計、電泳儀(Bio-Rad 公司，美國)、微型離心機(Sigma 公司，美國)、熒光倒置顯微鏡(Nikon公司，日本)。

1.2方法

1.2.1HUVECs細胞的培養HUVECs細胞復蘇，接種至75 cm的培養瓶中(0.2%明膠鋪被)，于37 ℃、5%CO2培養箱中采用DMEM培養基培養(含10%胎牛血清)，貼壁后換液，細胞生長融合后傳代。繼續培養，選取第3～4 代亞融合狀態的HUVECs進行實驗。

1.2.2pAAV-CD151、pAAV-CD151-QRD、pAAV-anti-CD151質粒的轉染HUVECs細胞分為對照組、CD151組、CD151-QRD組、anti-CD151 4組。對照組采用FUgene-HD及等體積磷酸鹽緩沖液(PBS)，其余組將質粒與FUgene-HD配成混合體系(質粒終濃度為2 μg/100 μL，FUgene-HD轉染試劑濃度為6 μL/100 μL)，將100 μL體系溶于OP-TIM-DMEM中，混勻后，室溫下孵育15 min，置于37 ℃，5%CO2培養箱，待細胞長至70%～80%密度。轉染48 h檢測目的基因蛋白的表達。

1.2.3管腔形成實驗檢測HUVECs的血管生成能力及血管穩定性的維持Matrigel鋪24孔板(每孔約加入100 μL融化的Matrigel并緩慢凝固)，實驗前1 d饑餓處理細胞(更換無血清培養基)。調整細胞計數板濃度至每毫升1×105個，加入500 μL細胞懸液，12、36、72 h后觀察管腔形成情況。

1.2.4細胞蛋白質的提取及濃度測定用刮法提取各時間點各組細胞總蛋白。各組取等量的細胞總蛋白常規電泳、轉膜、孵育；加入相應抗體，4 ℃過夜后加入相應的二抗(1∶5 000)，常溫封閉，洗去二抗，采用電化學發光(ECL)在暗室中曝光；采用灰度分析軟件，分析目的條帶相對吸光度值，數據用相應的β-actin 進行標準化處理。

1.2.5Western blotWestern blot 法檢測各組CD151、Rac和cdc42蛋白表達，計算相對吸光度值。

2　結　　果

2.1CD151蛋白表達CD151組(1.86 ±0.15)CD151蛋白表達明顯高于對照組(0.90 ±0.06)，差異有統計學意義(P<0.01) ；CD151-QRD組(1.75 ±0.16)與CD151組相比CD151蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)，但anti-CD151組蛋白表達(0.51±0.06)明顯下降。

2.2Matrigel上血管生成的能力在12 h時 Matrigel上CD151及其他各組之間血管生成差異無統計學意義(P>0.05)。36 h時，各組血管生成有區別。但是72 h時，CD151組Matrigel上血管生成明顯高于其他各組，其他各組的生成的血管不能維持(圖1)。顯示：CD151促進體外血管生成并可維持生成血管的穩定性，而CD151-QRD組、 anti-CD151組血管生成和維持血管生成能力明顯下降。

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與CD151組比較。

圖2Western blot檢測cdc 42、Rac信號通路蛋白表達

2.3Western blot法檢測信號通路CD151高表達促進cdc 42、Rac蛋白表達增加，CD151-QRD組、 anti-CD151組蛋白表達則較CD151組下降(圖2)。CD151促進cdc 42、Rac信號通路激活；anti-CD151組cdc 42、Rac信號通路激活明顯下降，QRD破壞CD151引起的cdc 42，Rac信號通路激活。

3　討　　論

內皮細胞間黏附連接的建立是血管形成的關鍵環節，無論是機體最初的血管形成還是在原有血管基礎上的血管再生，均以內皮細胞網絡結構形成為前提，內皮細胞間的節點形成，是各種不同類型血管形成的關鍵調節者[9]。前期研究表明，CD151在血管形成的過程中發揮著極為重要的作用[10-12]。CD151定位在極化內皮基底膜的外側，可能通過與整合素相互作用，參與整合素相關的內皮細胞-細胞間的黏附，調節血管形成及穩定性維持。

本研究采用前期構建的整合素結合缺陷的CD151-QRD 突變體，以及采用反義核苷酸技術構建的anti-CD151基因[13]。體外內皮細胞管腔形成實驗研究中證實，CD151 基因表達增加，其體外血管再生能力明顯增強，相同時間內，內皮細胞節點形成數目明顯高于對照組，抑制CD151 的表達，內皮細胞管腔形成受到抑制。對于整合素結合缺陷的CD151-QRD 突變體研究，本研究發現，內皮細胞管腔形成能力明顯被削弱，這可能與突變體組中內皮細胞黏附、遷移、侵襲能力被削弱有關。隨著時間的推移，36 h，各組血管生成有區別。72 h后，CD151 高表達組血管結構清晰完整，但其余各組新形成的血管結構均有不同程度的破壞，以CD151表達抑制組破壞最為明顯。因此，本研究認為，CD151 是通過與整合素結合形成復合物促進和維持細胞黏附結構形成及黏附穩定性維持，影響內皮細胞遷移、侵襲等血管形成的相關事件，最終促進體外內皮細胞血管形成，維持血管穩定性的。

Cdc42 與Rac 協同作用，參與調節血管再生中內皮細胞管腔形成的過程[14-15]。本研究觀察到CD151-QRD 突變體、anti-CD151削弱了Rac、cdc42 的激活，而CD151 高表達的內皮細胞，Rac、cdc42激活明顯增強。Rac、cdc42的激活促進了細胞間黏附連接的建立，最終促進內皮細胞血管形成，維持新生血管的穩定性。

研究表明CD151是調節內皮細胞Rac、cdc42信號分子活動的上游蛋白，同時還通過與整合素的相互作用促進內皮細胞黏附連接的建立及功能完整性的維持，最終促進內皮細胞體外管腔形成，并維持新生血管的穩定性。

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The promotion of CD151 on activation of Rac/cdc42 signaling pathway and its maintenance on angiogenesis′s stability in vitro*

LiuTao1，LiPengcheng2，LiuZhaoyu2，LiuZhengxiang2，ZuoHoujuan2△

(1.DepartmentofCardiology，PuaiHospital，AffiliatedHospitalofTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan，Hubei430000，China；2.DepartmentofCardiology，TongjiHospital，AffiliatedHospitalofTongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan，Hubei430000，China)

ObjectiveTo discuss the effect of CD151 and QRD mutant on Rac/cdc42 pathway and the angiogenesis capabilities and vascular stability.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells (HUVEC) lines were transfected(pAAV-CD151,pAAV-CD151-QRD,pAAV-anti-CD151) by plasmid liposome-mediated transfection,HUVECs cells were divided into control group,CD151 group,CD151-QRD group,and anti-CD151 group.Lumen formation on Matrigel was used to evaluate the angiogenesis capacity and stability of neovascularization in different times.The levels of CD151,Rac and cdc42 protein were tested by Western blot.ResultsCD151 expression in endothelial cells was significantly higher in CD151 group (1.86±0.15) than that in the control group(0.90±0.06),with statistical difference(P<0.01),but had no statistical difference between CD151 group and CD151-QRD group (1.75±0.16，P>0.05),and it was significantly lower in anti-CD151 group (0.51±0.06) than that in CD151 group.There was no significant difference in angiogenesis capabilities between CD151 and other groups at 12 hours(P>0.05),the angiogenesis differed in each group at 36 hours.CD151 groups′ matrigel angiogenesis was significantly higher than other groups′,and blood vessels could not be maintained in other groups at 72 hours.High expression of CD151 could promote higher expression of Rac and cdc 42 protein than the CD151-QRD group and the anti-CD151 group.ConclusionCD151 promotes the activation of Rac and cdc 42 signaling pathway,and promotes angiogenesis and the maintenance of stability in vitro angiogenesis.

CD151;umbilical veins;endothelial cells;angiogenesis;vascular stability

·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.24.001

國家自然科學基金資助項目(81000047)；湖北省衛計委青年人才項目(WJ2015Q031)。作者簡介：劉濤(1981-)，博士，副主任醫師，主要從事冠心病介入治療的研究。△

，Tel：15827048456；Email:zuohoujuan@126.com。

R543.5

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1671-8348(2016)24-3313-03

2016-02-08

2016-06-28)