軟骨脫細胞基質-Ⅱ型膠原制備組織工程軟骨納米支架的實驗研究*

蔣婷　楊澤龍　李小兵　馮剛

( 川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院 1.燒傷整形美容外科,2.骨科， ；3.組織工程與干細胞研究所， 四川 南充 637000)

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·論著·

軟骨脫細胞基質-Ⅱ型膠原制備組織工程軟骨納米支架的實驗研究*

蔣婷1楊澤龍2李小兵1馮剛3

( 川北醫學院第二臨床醫學院·南充市中心醫院 1.燒傷整形美容外科,2.骨科， ；3.組織工程與干細胞研究所， 四川 南充 637000)

目的探索軟骨脫細胞基質CAEM-Ⅱ型膠原(COLⅡ)通過靜電紡絲法制備組織工程納米支架的可行性。方法將兔肋軟骨脫細胞、脫脂、酶解后干燥獲得CAEM，再將CAEM和COLⅡ按質量比1∶2的比例混合，通過靜電紡絲技術制備組織工程納米支架，通過測定其吸水率、降解率等檢測支架的理化性能，用CCK8法評價其細胞毒性及粘附性情況。結果CAEM -COLⅡ納米支架纖維直徑為(627±165.4)nm，吸水率為(623.0±27.4)%，35天降解率為(45.6±5.8)%，CCK8法檢測結果顯示CAEM-COLⅡ復合支架對軟骨細胞具有良好的粘附性，生物學性能良好。結論CAEM- COLⅡ納米支架能為軟骨細胞的生長和增殖提供優良的微環境，在組織工程軟骨重建中具有潛在的應用價值。

組織工程納米支架；Ⅱ型膠原；軟骨脫細胞基質；靜電紡絲

創傷和關節退行性變導致的關節軟骨缺損是臨床常見疾病，常導致關節疼痛、畸形及功能障礙，使患者的生活質量明顯下降，甚至喪失勞動能力。目前臨床治療主要依靠非手術治療和關節置換手術。非手術治療能使部分患者的疼痛癥狀明顯緩解，使關節功能得到一定程度地改善。但許多患者進行非手術治療后效果差而不得不選擇手術，手術治療近期效果良好。而手術風險及并發癥使少部分患者面臨更加痛苦的境地。21世紀初有研究者通過軟骨細胞注射或軟骨細胞膜片移植的方法來治療軟骨缺損疾病，部分患者獲得一定的療效。不過如何讓細胞在軟骨缺損處濃聚及細胞膜片如何牢固固定等問題難以解決，使得這些方法無法得到臨床醫生的認可及推廣應用，但這開啟了組織工程軟骨治療軟骨缺損疾病的嶄新一頁。本研究著重在于探索通過靜電紡絲技術制備軟骨脫細胞基質-Ⅱ型膠原(Cartilage acellular extracellular matrix-Collagen Ⅱ,CAEM -COLⅡ)組織工程軟骨納米支架，通過對支架理化性能及細胞毒性的檢測，顯示該支架在軟骨組織工程構建中具有潛在的應用價值。

1　材料與方法

1.1主要實驗動物、試劑及儀器成年日本大耳兔10只，1周齡日本大耳兔2只，由川北醫學院實驗動物中心提供。所用動物實驗方案均通過川北醫學院動物實驗管理委員會批準。三氟乙醇(成都貝斯特試劑有限公司，中國)、Trition X-100(北京化學試劑公司)，胃蛋白酶(上海藍季科技發展有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)、碳化二亞胺(EDC)、DNase、RNase、鹽酸胍 (Sigma公司，美國)，Tris-HCl、高壓電源(天津東文公司，中國)、恒流注射泵(保定蘭格公司，中國)、掃描電鏡(Hitachi公司，日本)、CO2培養箱(Thermo公司，美國)、真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)，FD-1冷凍干燥機(北京博醫康)，Biofuge Primo R低溫離心機(Thermo Scientific, 美國)。

1.2方法

1.2.1脫細胞基質的制備將成年兔肋軟骨去除表面的軟組織后，剪碎至約0.5 cm大小，加入5倍軟骨體積的0.25%胰酶37 ℃消化35 min， 600 g離心5分鐘，PBS洗3次。加入2倍軟骨體積，PH為7.5含1%TritonX-100和0.35 mg/L PMSF的10 mmol/L的Tris-HCL緩沖液，在4 ℃下持續震蕩24 h去細胞，600 g離心5 min后PBS洗三次。加入1倍軟骨體積的50 u/mL DNA酶和1 u/mL RNA酶37 ℃消化過夜，再次400 g離心5 min后，ddH2O洗3次后收集軟骨脫細胞基質碎粒。將軟骨碎粒放入50 mL離心管，倒入適量液氮將其充分冷凍，取出冷凍后的軟骨粒立即放入粉碎機粉碎成粉末狀。加入適量甲醇-氯仿液(體積比為2∶1)脫脂24小時，400 g離心5 min，PBS洗3次，獲得不溶性軟骨細胞外基質沉淀。加入至少5倍體積的1%胃蛋白酶(w/v)在20 ℃下酶解36小時，400 g離心5分鐘去沉渣，再將所獲得的液體低溫冷凍干燥84小時后獲得可溶性軟骨脫細胞基質。

1.2.2COLⅡ的提取參照前期文獻報告[1]。

1.2.3納米支架的制備將軟骨脫細胞基質和COLⅡ按1∶2(w∶w)的比例混合，溶于三氟乙醇和ddH2O(v∶v=1∶1)溶劑中，常溫磁力攪拌72小時后制成10%(w/v)的靜電紡絲溶液。經過前期預實驗情況，固定電紡條件，空調控制室溫為25 ℃～30 ℃，濕度為40%，紡絲電壓為15 Kv，送液速度為6 ml/h，接收距離為10 cm，靜電紡絲采用銅板接收。將接收納米纖維的銅板置于真空干燥箱，真空度-0.1 MPa，室溫干燥3天后，收集纖維膜行相關參數檢測。

1.2.4支架電鏡觀察及纖維直徑測定，按文獻的方法[2]：材料表面經離子噴射儀噴金后在掃描電鏡下觀察其表面形貌及纖維直徑和孔隙情況；選取每個材料的10 000倍電鏡圖片，利用Image-Pro Plus 6.0 專業圖像分析軟件，隨機測定每個圖片內20根纖維直徑，再用SPSS 18軟件計算出纖維的平均直徑及標準差。

1.2.5支架吸水率的測定取數個樣品分別稱重得W1，再將樣品浸入雙蒸水中，在設定的時間點取出后稱重得W2，按公式吸水率=(W1-W2)/W1計算出材料的吸水率。

1.2.6CCK8法檢測細胞毒性與粘附情況支架材料剪成適當大小，環氧乙烷消毒后置于96孔培養板中，軟骨細胞接種密度為5×104cell/mL，分別在3 h、 6 h、9 h、12 h、24 h吸出舊培養液后加入PBS沖洗三次，再向孔內加入無血清和雙抗的培養液200 μL及20 μL的CCK8培養1～4 h，測定其在450 nm的吸光度，每個時間點均有三個樣本。以相同密度的軟骨細胞接種于細胞培養板為對照組并設置相應時間點作比較。

2　結果

2.1材料大體觀察軟骨細胞外基質提取物(圖1)，納米支架大體形態(圖2)。納米絲光鏡下觀察(圖3)及支架在電鏡下形態(圖4)顯示納米纖維直徑相對均勻，無明顯串珠形成，納米纖維間孔隙相通，表面形貌良好。

2.2支架物理性能檢測材料吸水能力在4小時達到飽和，吸水率平均為(623.0±27.4)%(圖5)。材料降解在14天后逐漸平穩，35天降解率為(45.6±5.8)%(圖6)。納米纖維的直徑為(627±165.4)nm。

圖1軟骨細胞外基質

Figure1Cartilage acellular extracellular matrix

圖2材料實體圖

Figure2Entity graph of the material

圖3納米纖維光鏡下觀察(×400)

Figure3Nanometer fiber were observed under the light microscope

圖4掃描電鏡下觀察(×5000)

Figure4Scanning electron microscope

圖5材料吸水率曲線

Figure5Water absorption rate curve of the material

圖6材料降解曲線

Figure6Degradation rate curve of the material

2.3細胞粘附性檢測實驗組和對照組在3 h、6 h、 9 h、12 h、24 h差異無顯著統計學意義(P>0.05)。CCK8檢測結果表明軟骨脫細胞基質- COLⅡ納米支架對細胞具有良好的粘附性，生物學性能良好，見圖7。

3　討論

組織工程軟骨是目前研究較多，發展最為熱門的科學之一。對種子細胞的研究非常廣泛，但如何有效維持種子細胞的表型一直是困擾研究者們的問題，至今尚未取得突破性進展。目前通常利用細胞因子來維持軟骨細胞或誘導后的類軟骨細胞表型，但隨著體外連續培養時間的延長，種子細胞表型逐漸喪失并向“類成纖維細胞”分化，難以成功構建出組織工程軟骨。如何改善組織工程支架的生物學性能逐漸受到科研工作者們的關注。

圖7細胞粘附評價

Figure7Cell adhesion evaluation

理化性能及生物學功能良好的支架是組織工程軟骨構建能否取得成功的關鍵之一，支架不僅為種子細胞提供生長分化及代謝的場所，同時還決定著重建組織器官的基本形態和功能[1]。目前常用于組織工程支架制備的原料主要分為天然材料、人工合成材料及兩者的混合材料三大類，它們各自具有優缺點，難以相互替代。人工合成材料構建的支架，最大的優點在于具有良好的機械性能，為構建組織提供較好的表面形貌。人工合成材料其生物相容性相對較差，缺乏細胞生長粘附因子，在體內降解速度不易控制，降解產物具有一定的細胞毒性[3-5]。但并不說明人工合成材料就無法獲得更好的應用前景。Pan等利用不同孔隙率的聚乳酸雙層支架復合骨髓基質干細胞修復兔關節軟骨缺損，經過12周后觀察發現，不同孔隙率的聚乳酸支架比單一孔隙率支架對軟骨缺損修復具有更良好的效果[6]。Hung等以聚氨酯為原料并攜帶細胞因子，利用低溫3D打印技術制備出三維支架，該支架復合骨髓基質干細胞對兔膝關節缺損表現出較好的修復功能[7]。

天然材料及其衍生物具有良好的生物相容性、可降解性能支持軟骨細胞粘附定植，能較好維持軟骨細胞表型從而被廣大研究者青睞。天然軟骨細胞外基質材料制備支架的常用方法為脫細胞軟骨塊、脫細胞軟骨外基質經低溫冷凍干燥法制備支架。孫良等通過軟骨脫細胞后制成支架，將骨髓基質干細胞接種于該支架后連續體外培養，骨髓基質干細胞能在支架表層生長[8]。這說明經軟骨脫細胞制備的支架孔隙稀少，細胞難以長入支架內部，無法將大量的種子細胞濃聚于支架中，因此無法作為軟骨組織工程理想的支架。低溫冷凍法一般是將軟骨脫細胞后粉碎，經低溫冷凍干燥，制備出特定形狀的三維多孔支架，經體外實驗表明細胞外基質支架具有良好的生物學性能[9-11]。

COLⅡ是關節軟骨細胞外基質的主要固相成分，占關節軟骨(AC)干重的50%～80%，主要構成AC的纖維骨架，與高含水量的PG長鏈共同構成網絡狀基質[1]。大量的研究證實，COLⅡ具有促進軟骨細胞粘附、增殖和維持軟骨細胞表型的作用[12-15]。在既往的研究中，以軟骨細胞外基質微粒為基本單位構建的支架容易脆裂，而且軟骨外基質微粒內部的膠原、透明質酸、膠原等的分子信號不能充分顯露。本研究以軟骨脫細胞基質經脫脂脫細胞去抗原后，再酶解使其以分子狀態成為可溶性基質，再通過加入COLⅡ充分攪拌混勻調節溶液粘度，利用靜電紡絲技術，制備出納米級組織工程軟骨支架，初步取得了較好的效果。經過多次對比試驗發現，靜電紡絲條件為電紡液中膠原和細胞外基質質量比為大于2∶1，電紡液最佳濃度為10%，溫度為25 ℃，濕度為40%，接收板距離為10 cm， 靜電紡絲速度為1 mL/h。

4　結論

軟骨脫細胞基質-COLⅡ構建的組織工程軟骨支架，具有較均一的納米級直徑，均勻的孔隙大小、較高的吸水率、良好的細胞粘附性能。該支架在結構和成分上能較好地模擬軟骨細胞生長的微環境，在軟骨組織工程中具有一定的應用前景。

[1]蔣婷, 楊澤龍, 李凌云, 等. Ⅱ型膠原-透明質酸-軟骨脫細胞基質制備組織工程軟骨支架的實驗研究[J]. 西部醫學, 2013, 25(8): 1132-1135.

[2]楊澤龍. 利用膠原-透明質酸-硫酸軟骨素三元納米支架修復兔關節軟骨缺損的實驗研究[D]. 瀘州醫學院, 2014: 1-105.

[3]Li WJ, Richard T, Chukwuka O. A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells. Biomaterials, 2005, 26(6): 599-609.

[4]Liao J, Guo X, Grande-Allen KJ,etal. Bioactive polymer/extracellular matrix scaffolds fabricated with a flow perfusion bioreactor for cartilage tissue engineering. Biomaterials, 2010, 31(34): 8911-8920.

[5]Chung C, Burdick JA. Engineering cartilage tissue[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2008, 60(2): 243-262.

[6]Pan Z, Duan P, Liu X,etal. Effect of porosities of bilayered porous scaffolds on spontaneous osteochondral repair in cartilage tissue engineering[J]. Regen Biomater, 2015, 2(1):9-19.

[7]Hung KC, Tseng CS, Dai LG,etal. Water-based polyurethane 3D printed scaffolds with controlled release function for customized cartilage tissue engineering[J]. Biomaterials, 2016, 83(2):156-168.

[8]孫良, 李丕寶, 欒保華. 脫細胞基質軟骨支架的制備[J]. 中國組織工程研究, 2015, 19(16): 2494-2499.

[9]姚軍, 盧世壁, 彭江, 等. 關節軟骨細胞外基質源性軟骨組織工程取向支架的制備[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2009, 13(3): 432-436.

[10] 楊強, 彭江, 盧世壁, 等. 軟骨脫細胞基質多孔支架與骨髓基質干細胞體外構建組織工程軟骨的研究[J]. 中華醫學雜志, 2011, 91(17): 1161-1166.

[11] 余曉明, 孟昊業, 孫振, 等. 生物反應器中的力學刺激促進組織工程軟骨再生[J]. 中國組織工程研究, 2016, 20(2): 185-190.

[12] 楊澤龍, 陳竹, 劉康, 等. Ⅱ型膠原-透明質酸構建組織工程軟骨復合三維納米支架的體外實驗研究[J]. 中國修復重建外科雜志, 2013, 27(10): 1240-1245.

[13] Zhang S, Chen L, Jiang Y,etal. Bi-layer collagen/microporous electrospun nanofiber scaffold improves the osteochondral regeneration[J]. Acta Biomater, 2013, 9(7):7236-7247.

[14] Chen WC, Wei YH, Chu IM,etal. Effect of chondroitin sulphate C on the in vitro and in vivo chondrogenesis of mesenchymal stem cells in crosslinked type II collagen scaffolds[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2013, 7(8):665-672.

[15] Choi B, Kim S, Lin B,etal. Cartilaginous extracellular matrix-modified chitosan hydrogels for cartilage tissue engineering[J]. ACS Appl Mater Interfaces, 2014, 6(22):20110-20121.

The study on preparation of nanofiber scaffolds with CAEM- COLⅡ for cartilage tissue engineering

JIANG Ting1, YANG Zelong,LI Xiaobin1,et al

(1.DepartmentofBurnandPlasticSurgery,NanchongCentralHospital·heSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofOrthopaedicSurgery,NanchongCentralHospital·TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China;3.TissueEngineeringandStemCellInstitute,NanchongCentralHospital·TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveTo explore the feasibility of preparation of nanofiber scaffolds by electrostatic spinning with cartilage acellular extracellular matrix (CAEM) and collagen Ⅱ (COLⅡ) for cartilage tissue engineering. Methods CAEM was obtained from the rabbit rib cartilage after removing the chondrocytes, degreasing, enzymolysis and drying. CAEM and COLⅡ were Mixed according to the ratio of 1∶2. The nanofiber scaffolds were prepared by electrostatic spinning for cartilage tissue engineering. The physical-chemical properties of the scaffolds were detected through mensurating the porosity, water absorption rate, and degradation rate. The cytotoxicity and cell adhesion were evaluated by CCK8 test. ResultsThe diameter of the CAEM-COLⅡ nanofiber scaffolds was 627nm±165.4nm. The water absorption rate was 623.0%±27.4%, and the degradation rate was 45.6%±5.8% after 35 days. CCK8 test showed that the CAEM-COLⅡ blend scaffolds had good cell adhesion and physical-chemical properties. ConclusionThe CAEM-COLⅡnanofiber scaffolds could provide fine microenvironment for the growth and proliferation of chondrocyte. It had potential application value in cartilage tissue engineering.

Tissue engineering nanofiber scaffolds; Collagen Ⅱ; Cartilage acellular extracellular matrix; Electrostatic spinning

國家自然科學基金青年基金(81301568)；川北醫學院博士科研啟動基金(CBY15-QD03)

R 318.08

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.005

2016-04-22； 編輯： 張文秀)