人退行性變髓核細胞體外分離培養及鑒定*

羅栩偉　李艷　劉康　馮剛　陳竹

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院組織工程與干細胞研究所， 四川 南充 637000)

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·論著·

人退行性變髓核細胞體外分離培養及鑒定*

羅栩偉李艷劉康馮剛陳竹

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院組織工程與干細胞研究所， 四川 南充 637000)

目的觀察體外分離培養的人退行性變髓核細胞形態學表現，并分析其生物學特性。方法收集人退變髓核組織，胰酶聯合Ⅱ型膠原酶消化分離出髓核細胞行平面培養并傳代，倒置顯微鏡觀察細胞形態及生長情況，并分別在1w、2w、3w三個時間點通過硫酸化的糖胺聚糖含量測定、免疫組化染色、Safranin-O染色、Real-time PCR對髓核細胞進行生物學特性分析及鑒定。結果髓核細胞呈星形、多角形、梭形，部分胞漿突起，伸出偽足，與軟骨樣細胞形態相近，傳代后細胞形態體積較原代大。髓核細胞能合成大量硫酸化的糖胺聚糖，細胞中富含蛋白多糖、Ⅱ型膠原，免疫染色呈陽性，隨著培養周數的增加，其著色深度無明顯強化。Safranin-O染色將細胞核染成紅色，胞漿淡染，隨著培養日期的延長，其紅色強度無明顯加深。Real-time PCR檢測到Aggrecan、CollagenⅡ兩基因在1w、2w、3w均持續穩定的表達，各觀察點間無統計學差異(P>0.05)。結論胰酶聯合Ⅱ型膠原酶消化法操作簡單，培養效率高，傳代培養的髓核細胞增殖速度快，經鑒定具有典型的類軟骨細胞表征及良好的生物學特性，能持續穩定的表達蛋白多糖及Ⅱ型膠原。

髓核；細胞；培養；生物學特性

髓核(Nucleus pulposus，NP)為半透明膠凍狀組織，是椎間盤中心構成部分，它富含蛋白多糖、Ⅱ型膠原及大量水分等細胞外基質成分，具有高彈力及抗張力特性，對維持脊柱穩定及生理彎曲有著極為重要的意義[1-2]。髓核細胞的衰老凋亡、外基質降解、蛋白多糖及Ⅱ型膠原含量減少、水分丟失等一系列生化改變是椎間盤退行性變(Intervertebral disc degeneration，IDD)發生發展的重要原因[3-5]。基因干預、細胞移植、髓核組織工程構建等是椎間盤退變髓核生物治療的主要手段[6-7]。因此，為了能更好模擬髓核生物學性能，對髓核細胞生物學特性的研究顯得尤為重要。本研究擬通過體外分離培養人退行性變髓核細胞，從多角度觀察并分析其類軟骨細胞的形態學表型及生物學特性，為進一步拓展椎間盤退行性變髓核生物治療研究提供一種新的細胞培養模式及詳實可靠的細胞形態生物學依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1髓核組織來源收集的5例退行性變髓核組織，為2015年7～12月期間在南充市中心醫院行腰椎間盤突出癥經后路椎板開窗髓核摘除術所切除的髓核組織，術前經CT、MRI確診，術后經病檢證實為髓核組織退行性變，Thompson 分級屬Ⅳ、Ⅴ級[8]。患者年齡均在45～60歲之間，L4/5 3例，L5/S1 2例。

1.1.2主要試劑FBS、DMEM(Hyclon)；0.25%胰酶-EDTA(Invitrogen)；II型膠原酶、牛睪丸透明質酸酶、木瓜蛋白酶、HoeChst 33258、Safranin-O、Fast Green、DMMB(Sigma)；Collagen II免疫組化試劑盒(Chondrex)；Aggrecan抗體(Santa Cruz)；BSA(TaKaRa)；逆轉錄試劑盒(Fermentas)；iQ SYBR Green(Bio-Rad)；DAB顯色液(武漢博士德生物有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1髓核的分離培養從手術摘除椎間盤中仔細分離出髓核組織，PBS沖洗3遍，用眼科剪將髓核組織剪碎至1 mm3大小，將組織混合液轉入15 mL的離心管中，1 500 rpm離心5min，去上清，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA，37 ℃恒溫水浴消化20 min，1 500rpm離心5 min，去上清，加入0.2%Ⅱ型膠原酶，37℃恒溫水浴消化2 h，1 500 rpm離心5 min，去上清，重復Ⅱ型膠原酶消化步驟再次消化離心后，用適量20%FBS的DMEM培養液漂洗，1 500rpm離心5 min，去上清，重復漂洗步驟 3次。最后用20%FBS的DMEM培養液1 mL吹散細胞，計數板進行細胞計數，按2×105/mL接種于75 cm2培養瓶中，用20%FBS的DMEM培養液10 mL重懸，將培養瓶置于含95%空氣、5%CO2的37 ℃細胞培養箱中培養，每2～3 d換培養液1次，倒置顯微鏡逐日觀察細胞貼壁及生長情況并拍照，當細胞生長至80%～90%融合后進行傳代培養。

1.2.2髓核細胞生長曲線的測定取第2代髓核細胞，按細胞密度為4×105/mL接種于6個75 cm2培養瓶中進行培養，分別在接種后的第3、7、10、14、21、28 d， 各取1個培養瓶用胰酶消化后進行細胞計數，算出每mL的細胞數，并繪制細胞生長曲線圖。

1.2.3硫酸化的糖胺聚糖(Sulfated Glycosaminoglycan，sGAG)/DNA測定

1.2.3.1sGAG含量測定取第2代髓核細胞，按細胞密度為8×104/mL接種于6孔板，設置1w，2w，3w，3個觀察時間點，每組3個孔，用2%FBS的DMEM培養液培養。分別于每個觀察點取出1個6孔板，用PBS洗凈后每孔加入木瓜蛋白酶2 mL，置于56℃恒溫水浴鍋中消化24小時。取0.5 mL混合液轉移到15 mL離心管，依次加入100 mM碘乙酸0.5 mL、 0.5M Tris-HCl 0.5 mL、50 mM Tris-HCl(PH8.0)3 mL、DMMB顯色液2.5 mL，混勻反應15 s，于525 nm處測定吸光度值。配制1～100 μg/mL硫酸軟骨素標準液并繪制標準曲線，并根據標準曲線計算樣品中sGAG含量。

1.2.3.2DNA測定按照Hoechst 33258說明書稀釋1 mg/mL小牛胸腺DNA、1 mg/mL Hoechst 33258，并配制1～100 μg/ml標準液，打開熒光分光光度計開關，預熱15 min，設置激發波長360 nm，發射波長460 nm，繪制標準曲線。清洗比色杯，加入500 μL經木瓜蛋白酶消化后待測樣品和1.5 mL染液，混勻，上機讀數記錄，根據標準曲線計算出樣品中DNA含量。

1.2.4Aggrecan免疫熒光檢測按1.2.3.1準備細胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板，PBS洗3次，甲醇固定10 min，PBS洗3次，5%BSA封閉液室溫封閉1小時，將一抗用5%BSA封閉液按一定比例稀釋后加入到6孔板，1 mL/孔，4℃冰箱孵育過夜；次日復溫30 min，去一抗，PBS洗3次，加二抗，置于37 ℃恒溫水浴鍋孵育1小時，去二抗，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.2.5CollagenⅡ免疫組化檢測按1.2.3.1準備細胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板，PBS洗3次，用預冷的2.5%戊二醛固定10 min，PBS洗3次，2%牛睪丸透明質酸酶室溫封閉30 min，PBS洗3次，加入適量0.1%～1%過氧化氫室溫下放置10 min，PBS洗3次，加入Blocking Buffer放置30 min，PBS洗3次，加一抗，按1∶250用Antiboby Dilution液稀釋，4 ℃冰箱孵育過夜，次日鍋，復溫30 min，去一抗，PBS洗3次，添加Streptavidin Peroxidase，按1∶5用Streptavidin Peroxidase Dilution Buffer稀釋，室溫下孵育1小時，去Streptavidin Peroxidase，PBS洗3次，加入DAB顯色液，在顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.2.6Safranin-O染色按1.2.3.1準備細胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板， ddH2O洗3次，蘇木素染色6 min，ddH2O洗10 min，2% Fast Green染色3 min，1%鹽酸-酒精脫色5 min，0.1% Safranin-O染色5～10 min，ddH2O洗2次，顯微鏡下觀察染色結果并拍照。

1.2.7Aggrecan、CollagenⅡmRNA表達情況按1.2.3.1準備細胞，分別于每個觀察點取出1個6孔板，抽提髓核細胞RNA，逆轉錄為cDNA，反應條件為：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。以Human β-action為內參基因，作Real-time PCR擴增并進行分析，引物序列見表1。

1.2.8統計學分析本實驗所有數據將采用SPSS 17.0統計軟件進行分析，實驗結果以均數±標準差表示，組間比較用獨立樣本t檢驗，以P<0.05定義為差異有統計學意義。

表1　Aggrecan、Collagen II及內對照β-action基因的引物序列

2　結果

2.1髓核細胞生長曲線傳代后的髓核細胞24小時大部分貼壁，生長較原代迅速，7天后進入對數生長期，2～3w鋪滿瓶壁，3～4w部分細胞生長、增殖停止，少許細胞衰老或死亡，見圖1。

2.2sGAG/DNA髓核細胞合成大量sGAG，并能持續穩定的表達。雖隨培養周數sGAG含量有所增加，但三組間比較差異并無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

圖1傳代髓核細胞生長曲線

Figure1Growth curve of the second passage of NP cells

圖2髓核細胞sGAG/DNA

Figure2Levels of sGAG normalized to DNA content in NP cells

2.3髓核的培養退變髓核組織中細胞含量較少，原代消化后，較少細胞貼壁，細胞生長增殖很緩慢。7天后貼壁細胞增多，生長迅速，細胞呈星形、多角形、梭形，部分胞漿突起，并伸出偽足，與軟骨樣細胞形態相近。10天后部分細胞融合成片，堆積生長，開始進入對數生長期。3～4w鋪滿瓶壁，進行傳代。傳代后的髓核細胞形態體積較原代大，貼壁時間短，生長較迅速，余無明顯變化，見圖3。

2.4Aggrecan免疫熒光檢測髓核細胞中富含蛋白多糖，三個觀察點均能檢測到大量蛋白多糖合成，免疫熒光染色均呈陽性，陽性染色主要出現在胞漿內，胞核幾乎不著色，隨著培養周數的增加，其著色深度無明顯強化，見圖4。

2.5CollagenⅡ免疫組化檢測髓核細胞在培養1w、2w、3w均有大量Ⅱ型膠原合成，免疫組化染色呈陽性，胞漿被染成棕黃色，隨著培養時間的延長，各個觀察點著色深度基本一致，見圖5。

2.6Safranin-O染色三個時間點髓核細胞蛋白聚糖Safranin-O染色均呈陽性表達，細胞核被染成紅色，胞漿淡染，隨著培養日期的增加，其紅色強度并無明顯加深，見圖6。

2.7Aggrecan、CollagenⅡ mRNA表達水平Real-time PCR檢測到Aggrecan、CollagenⅡ基因在1w、2w、3w均能持續穩定的表達，兩基因在各觀察點表達水平相當，差異無統計學意義(P>0.05)(圖7)。

圖3髓核細胞的形態孢子(×100)

Figure3Morphology of NP cells

注：A、B、C為原代培養髓核細胞，D、E、F為傳代培養髓核細胞，A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

圖4髓核細胞免疫熒光染色檢測蛋白多糖的表達(×200)

Figure4Immunofluorescent staining of NP cells for aggrecan

注：A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

3　討論

椎間盤退行性變疾病為臨床常見病和多發病，是引起下腰痛的主要病因。其主要生化改變為蛋白多糖和Ⅱ型膠原生成減少、水分含量丟失、細胞衰老凋亡等呈“瀑布”樣反應的細胞外基質降解征象[9-11]。隨著現代生物治療技術的迅速發展和廣泛應用，椎間盤退變生物治療成為了當今眾多學者的研究課題，髓核作為椎間盤的中心構件也因此成為了科學研究的熱點。有相關研究證實，椎間盤退變的發生發展最先是從髓核的退變開始[5]。髓核為富含髓核細胞、蛋白多糖、Ⅱ型膠原及大量水分的半流體膠凍狀組織，它起著彈性緩沖外力的作用，能將所受壓力傳遞至纖維環以及椎骨，從而維持脊柱的穩定性及生理彎曲[12]。髓核細胞本質上是類軟骨細胞，它能合成大量的蛋白多糖、Ⅱ型膠原等物質，在維持椎間盤生物學及力學特性方面起著主導作用。基因干預、細胞移植、髓核組織工程構建等作為椎間盤退變髓核生物治療的主要手段，其研究基礎在于充分了解并掌握髓核細胞的形態學特征、生物學特性，才能更好地模擬符合人體生理的髓核生物學性能。

圖5髓核細胞免疫組化檢測Ⅱ型膠原的表達(×200)

Figure5Immunostaining of NP cells for type-Ⅱ collagen

注：A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

圖6髓核細胞Safranin-O染色檢測蛋白聚糖的表達(×200)

Figure6Safranin-O staining of NP cells for proteoglycan

注：A、D為1w，B、E為2w，C、F為3w

圖7髓核細胞Aggrecan (A)、Collagen Ⅱ (B) mRNA的表達

Figure7Gene expression patterns in NP cells

注： (A) Aggrecan mRNA levels; (B) Collagen Ⅱ mRNA levels

通常成人的椎間盤髓核細胞主要是由脊索細胞演化而來，屬于終末細胞。其增殖能力較弱，體外培養難度較大，對培養條件的要求較高，培養的時間較長。Grubar等用20%FBS培養椎間盤細胞，結果表明髓核細胞約需1個月時間才能從最初組織塊中長至P1代[13]。傳統組織塊培養法，細胞游離出髓核組織塊的時間較長，一般為2周，雖然該方法操作簡便，但貼壁的細胞較少，培養時間較長；單純胰酶消化法獲得的細胞貼壁時間較短，但由于退變的髓核組織中含有大量的膠原成分，尤其是Ⅱ型膠原，因此消化物中殘留大量膠原，會影響細胞的生長，培養的髓核細胞中將含有大量雜細胞，且胰酶消化時間的長短難以準確掌握；單純用低濃度膠原酶消化可以特異性水解膠原蛋白的超螺旋結構，但此方法消化的時間較長，且獲得的髓核細胞較少，若用較高濃度的膠原酶消化耗費較高[11]。本研究綜合胰酶和膠原酶消化的方法，獲得髓核細胞數量大且純正，傳代培養的細胞增殖速度快，細胞呈星形、多角形、梭形，部分胞漿突起，伸出偽足，與軟骨樣細胞形態相近。

在髓核細胞生物學特性的研究中，目前尚未明確特異性的標志物[14]，學者們普遍默認將蛋白多糖及Ⅱ型膠原視為髓核細胞的特征性產物進行鑒別。本研究中，我們在傳代培養的1w、2w、3w三個時間點利用免疫組化染色、Real-time PCR分別從蛋白水平、基因水平觀察到髓核細胞中有大量蛋白多糖、Ⅱ型膠原表達。此外，sGAG含量的測定常被用于評估細胞內糖胺聚糖水平，本研究中我們將sGAG總量比上細胞總DNA，消除了細胞數不同對測定值的影響，檢測到不同時間點sGAG的含量，并進一步通過Safranine-O染色檢測到髓核細胞內蛋白聚糖合成情況。因此，本研究從多角度形態學、生物學特性評價證實所培養細胞系人髓核細胞，它能在體外培養體系中持續穩定的表達自身細胞特性，合成大量的蛋白多糖及Ⅱ型膠原。本研究中我們還發現，最初的傳代髓核細胞基本保持了原代髓核細胞的生物活性，但隨著傳代次數的增加，不可避免的出現了細胞纖維化變性，導致細胞生殖、增長、活性大幅度下降。因此，如何提供一個使細胞保持原始形態生物學活性不變的生長環境將是我們下一步研究的課題。

4　結論

本研究采用胰酶聯合Ⅱ型膠原酶消化法成功分離培養出人退行性變髓核細胞，該法操作簡單，培養效率高，傳代培養的髓核細胞增殖速度快，經鑒定具有典型的類軟骨細胞形態學表征和良好的生物學特性，為進一步拓展椎間盤退行性變髓核生物治療，提供了一種新的細胞培養模式和詳實可靠的細胞形態生物學依據。

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Isolation, culture and identification of human degenerative nucleus pulposus cells in vitro

LUO Xuwei, LI Yan, LIU Kang, et al

(ResearchInstituteofTissueEngineeringandStemCells,NanchongCentralHospital·TheSecondClinicalInstituteofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveTo observe the morphological features and analyze the biological characteristics of human degenerative nucleus pulposus (NP) cells isolated in vitro. MethodsNP tissues were separated and collected from human degenerated intervertebral disc samples. After sequential enzymatic digestion of collagen II and trypsin, cells from the NP tissues were isolated and cultured in monolayer. The morphological features and growth of NP cells were observed by an inverted microscope after subculture. The biological characteristics of NP cells was analyzed and identified by the measurement of sulfated glycosaminoglycan (sGAG), Immunohistochemical staining, Safranine-O staining and real-time PCR at three time points. ResultsNP cells were star-shaped, polygonal and spindle-shaped, which were similar to the cartilage-like cells. After passage, the cell volume was larger than that of primary generation. We clearly observed that human NP cells can produce a large content of sGAG. Immunostaining of NP cells showed that type-II collagen was stained dark brown, and aggrecan showed red fluorescence. Safranin-O staining created a red appearance in all cell culture lines. The mRNA levels of collagen II and aggrecan were determined in NP cells using real-time PCR performed with the SYBR Green PCR kit. These researches confirmed that no significant effect was observed among each point. ConclusionThe sequential enzymatic digestion of collagen II and trypsin can simplify the isolation process of NP cells which can improve the culture efficiency. We observed that NP cells had a fast multiplication rate, typical exosyndrome of chondrocyte, and satisfactory biological characteristics. The expression of proteoglycans and collagen II were identified by a sustained and steady modality in NP cells.

Nucleus pulposus; Cell; Culture; Biological characteristics

國家自然科學基金資助項目(81201407、81171472、81071270、30872614)；四川省杰出青年學科帶頭人資助計劃(09ZQ026-005)；四川省科技支撐計劃項目(2010SZ0048)；南充市應用技術研究與開發資金項目(11A0115)；川北醫學院科研發展計劃重點培育項目(CBY11-A-ZP01)

馮剛，教授，本刊副主編，E-mail: genecloner@163.com

Q 813.1

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.004

2016-04-22； 編輯： 張文秀)