兔纖維環細胞培養及生物學特性的實驗研究*

白亦光　陳巧玲　馮剛　劉康　肖東琴

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院 1.骨科；2.腫瘤分院；3.組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

?

·論著·

兔纖維環細胞培養及生物學特性的實驗研究*

白亦光1陳巧玲2馮剛3劉康3肖東琴3

(南充市中心醫院·川北醫學院第二臨床醫學院 1.骨科；2.腫瘤分院；3.組織工程與干細胞研究所，四川 南充 637000)

目的建立兔椎間盤纖維環細胞體外培養體系，并對其生物學特性進行鑒定。方法采用酶消化法分離兔椎間盤纖維環細胞，進行單層培養，實驗在原代培養中使用體積分數為20%FBS的DMEM培養基。倒置相差顯微鏡觀察其形態結構和生物學特性，通過甲苯胺藍染色、免疫細胞化學染色和堿性磷酸酶染色等方法對其細胞表型進行鑒定，MTT法繪制髓核細胞生長曲線。 結果在相差顯微鏡下，單層培養的椎間盤纖維環細胞呈貼壁生長的梭形或多角形細胞, 細胞具有甲苯胺藍異染性；Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的表達陽性；細胞堿性磷酸酶染色陽性。結論采用酶消化法可成功培養兔椎間盤纖維環細胞，生物學特性鑒定符合纖維環細胞特征。

椎間盤；纖維環細胞；生物學特性；組織工程

椎間盤退行性變(intervertebral disc degeneration，IDD)是引起下腰痛的主要原因，它可引起一系列疾病如腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄癥、節段性腰椎不穩和退變性腰椎側凸等。關于IDD的病因和病理生理機制尚未完全明確，一般認為主要是椎間盤細胞及細胞外基質(蛋白聚糖和膠原等)的丟失，改變了椎間盤生物力學機制。目前主要治療方法是外科手術治療，這些方法在解除病變節段的同時，又使鄰近節段發生退變，還降低了關聯運動階段的靈活性，增加了鄰近節段的負擔。椎間盤退變必然會伴隨其細胞學的改變，包括一些椎間盤細胞基因的異常表達及細胞外基質成分發生改變等[1]。其中纖維環破裂被認為是重要的誘發因素而使纖維環在臨床和基礎研究中倍受關注。纖維環結構位于椎間盤髓核組織外周，由多層纖維板同心圓排列包繞凝膠狀的髓核組織，其纖維板層結構的完整性對于維持整個椎間盤系統的正常功能具有十分重要的意義[2]。纖維環細胞位于膠原纖維束之間，合成和分泌纖維環細胞外基質，維持正常的纖維環結構和功能[3]。

本實驗擬通過體外分離組織塊通過酶消化培養纖維環細胞，并通過多種細胞染色及免疫細胞化學方法綜合鑒定纖維環細胞，從而為體外培養纖維環細胞提供一個新方法，為研究椎間盤退變機制的研究提供細胞學實驗基礎。

1　材料和方法

1.1實驗動物與材料、儀器CO2孵箱(Thermo公司，美國)，超凈工作臺(Airtech公司，美國)，倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)。甲苯胺藍染液(碧云天公司，中國)，Ⅱ型膠原免疫細胞化學試劑盒(Chondrex公司，美國)，Ⅰ型膠原免疫細胞化學一抗山羊抗兔(Novus-Bio公司，美國)，Ⅰ型膠原免疫細胞化學二抗驢抗山羊(Novus-Bio公司，美國)，DAB顯色試劑盒(碧云天公司，中國)，胎牛血清(Hyclone公司，中國)，DMEM高糖培養基(Hyclone公司，中國)，BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色試劑盒(碧云天公司，中國)。健康2周齡日本大耳白兔4只，體重0.5～1.0 Kg，雌雄不限，由川北醫學院實驗動物中心提供。

1.2纖維環細胞的分離和原代培養取4只日本大耳白兔，1%戊巴比妥鈉100 mL/Kg靜脈注射過量麻醉處死；取背部正中切口切開皮膚，更換無菌手套和手術器械后沿棘突用剪剪開兩旁肌肉，沿椎弓根剪斷橫突，盡量剝盡椎旁肌肉和椎間盤前緣所附著肌肉，無菌條件下將腰段脊柱整段取出；用含青、鏈霉素0.01 mol/L PBS液沖洗3 遍以上至無明顯血跡，移入超凈工作臺，用手術刀片切斷纖維環上下椎體，盡可能保留纖維環；用眼科鑷將膠凍狀椎間盤髓核組織完整剔除干凈，將環狀纖維環結構放入含青、鏈霉素0.01 mol/L PBS液中，用眼科剪將纖維環剪成1 mm3的小塊，再用PBS 液漂洗2遍，800 r/min×2 min離心，收集沉淀。將沉淀組織放入50mL離心管，先用0.25%胰蛋白酶在37 ℃恒溫水浴箱中加熱消化預消化15 min，1000 r/min×2 min離心，去上清；然后加入0.2%的Ⅱ型膠原酶，在37 ℃恒溫水浴箱中加熱消化4 h，1000 r/min×5 min離心，收集絮狀沉淀以及未被消化的組織塊，用DMEM沖洗兩遍；再次離心后加入含20%FBS的DMEM培養基，之后移至25 cm2細胞培養瓶中，置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養箱中培養，每3天換1次液，倒置相差顯微鏡下逐日觀察細胞情況。

1.3纖維環細胞傳代培養原代細胞培養大約2周，鏡下可見細胞生長至近25 cm2細胞培養瓶底面積的90%時進行傳代，將培養液倒掉，用0.01 mol/L PBS洗滌細胞2次，棄掉液體，加入體積分數0.25%的胰蛋白酶(D-Hanks液稀釋)1 mL，晃動培養瓶使胰酶與細胞充分接觸，鏡下觀察消化情況，可見細胞皺縮、變圓，當有細胞漂浮時立即用含10% FBS的DMEM的培養液2 mL終止消化，再用移液管輕輕吹打細胞瓶底部數次制成細胞懸液，必要時再次鏡下觀察以確保細胞盡可能全部吹離細胞瓶底部，1000 r/min ×5 min離心棄上清液，加入上述培養基制成細胞懸液后按1∶2接種于75 cm2細胞培養瓶。

1.4纖維環細胞的生物學特性檢測

1.4.1光鏡下細胞形態學觀察將第3代傳代纖維環細胞按1×104個/mL接種至含蓋玻片的6孔培養板中進行細胞爬片。培養至細胞基本長滿單層時取出蓋玻片，光鏡下觀察細胞大體形態。

1.4.2甲苯胺藍染色將上述細胞爬片取出進行甲苯胺藍染色。染色步驟：細胞爬片PBS沖洗后4 多聚甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗3次；1 甲苯胺藍染色10 min，PBS沖洗3次；樹脂封片光鏡下觀察。

1.4.3細胞免疫細胞化學檢測將上述細胞爬片PBS沖洗后4 多聚甲醛室溫固定30 min。Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色步驟：2 牛透明質酸酶封閉30 min，3 過氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，添加block buffer室溫30 min，PBS沖洗，添加生物素一抗封閉(1∶250稀釋)4℃過夜，PBS沖洗，添加生物素二抗(1∶200稀釋)室溫1小時，PBS沖洗，DAB顯色1h，樹脂封片倒置顯微鏡下觀察。Ⅰ型膠原免疫組織化學染色步驟：2 牛透明質酸酶封閉30 min，3 過氧化氫封閉10 min，PBS沖洗，添加block buffer室溫30 min，PBS沖洗，添加生物素一抗(采用Ⅰ型膠原免疫細胞化學一抗，山羊抗兔，1∶250稀釋)4℃過夜，PBS沖洗，添加二抗(Ⅰ型膠原免疫細胞化學二抗，驢抗山羊，1∶200稀釋)室溫1小時，PBS沖洗，DAB顯色1小時，樹脂封片倒置顯微鏡下觀察。

1.4.4堿性磷酸酶檢測將上述細胞爬片磷酸鹽緩沖液沖洗3～5遍，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水沖洗3～5次，用新鮮配制的BCIP/NBT工作液37 ℃孵育1小時，蒸餾水沖洗3～5次，樹脂封片后倒置顯微鏡下觀察。

1.5MTT測定纖維環細胞生長曲線取原代細胞用含20%FBS的DMEM培養基配成單個細胞懸液，細胞計數1×104個/mL，以每孔體積200 μL加入96孔培養板中。分別于培養1、2、3、4、5、6、7、8 d，每孔加MTT溶液(5 mg/ mL)20 μL，繼續孵育4 h，終止培養，棄上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min。選擇 490 nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度(OD)值。

2　結果

2.1光鏡下纖維環細胞形態纖維環細胞輪廓清楚，多為長梭形、多角形、梭形或不規則形狀，細胞核為圓形或橢圓形，胞漿內可見較多空泡。原代培養時，倒置顯微鏡下觀察可見培養液中存在大量大小不等的圓形細胞懸浮，3d后細胞發生明顯變化，貼壁細胞伸出突起逐漸變為梭形并且較原代細胞體積增大，少數細胞呈現多角形，并開始增殖以后細胞突起相互連接，高倍鏡下可見細胞質豐富，細胞較大，輪廓清晰，核內可見核仁存在。1w左右大部分細胞貼壁延伸，體積變大，數目增多，培養基中偶見懸浮死亡細胞，見圖1。

2.2甲苯胺藍染色結果甲苯胺藍染色顯示細胞為梭形或多角形，細胞核完整，清晰可見，呈卵圓形，均一淡紫色，胞漿基質染為深藍色，見圖2。

2.3纖維環細胞堿性磷酸酶表達細胞堿性磷酸酶染色陽性，胞漿中可見棕黑色顆粒，見圖3。

2.4纖維環細胞Ⅰ，Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色結果兩組免疫細胞化學染色均可見陽性表達，胞漿呈棕黃色，而胞核淡染，見圖4。

圖1原代培養兔椎間盤纖維環細胞(×100)

Figure1Primary culture of rabbit annulus fibrosus cells (×100)

圖2纖維環細胞甲苯胺藍染色 (×400)

Figure 2Toluidine blue staining of cultured annulus fibrosus cells

圖3單層培養纖維環細胞堿性磷酸酶染色(×400)

Figure3Alkaline phosphatase staining of annulus fibrosus cells cultured in monolayer

圖4纖維環細胞Ⅰ型(a)和Ⅱ型(b)膠原免疫組織化學染色(×200)

Figure4Collagen I and II immunocytochemical staining of cultured annulus fibrosus cells

a:Collagen type Ⅰ;b:Collagen type Ⅱ

圖5纖維環細胞生長曲線

Figure5Growth curve of annulus fibrosus cells

2.5MTT測定纖維環細胞生長曲線將各孔每個時間點所測結果取均數，繪制的細胞生長曲線與體外細胞培養時觀察的生長過程相符，見圖5。

3　討論

椎間盤是連接兩椎體的緩沖裝置，主要由椎間盤細胞和細胞外基質構成，對于脊柱的活動及保持穩定的狀態起著重要的作用。椎間盤具有一定的壓縮、伸展和緩沖壓力的功能[4]。隨年齡的增加及各種因素的影響會逐漸發生退行性變化。椎間盤退變的病理改變之一為纖維環的應力損傷，纖維環微斷裂, 導致髓核組織從纖維環損傷處突出[5]。退變的早期, 具有

修復能力的纖維環細胞上調蛋白多糖和其它間質中的大分子, 內部纖維環蛋白多糖含量的增加可在一定程度上彌補了早期髓核蛋白多糖的下降[6]。退變的晚期，椎間盤內細胞含量明顯下降，導致椎間盤整體力學功能受損, 椎間盤內細胞外基質成分發生改變以致終板鈣化和營養供應受限。 隨纖維環細胞的自身修復能力的下降, 椎間盤發生不可逆的退變。

纖維環主要由纖維環細胞和細胞外基質構成。目前多種實驗結果均顯示纖維環細胞是一種纖維環軟骨細胞，表達Ⅱ型膠原和蛋白多糖等成分[6]，但對于其是否表達Ⅰ型膠原，學術界仍有爭議。有學者采用Northen blot等方法檢測培養的兔纖維環細胞mRNA 的表達情況，發現Ⅰ型膠原mRNA沒有表達或者表達量極為有限[7]。但是，Gruber等采用免疫組織化學方法，利用Ⅰ型膠原單克隆或多克隆抗體對培養的人纖維環細胞進行檢測，則檢測到Ⅰ型膠原的陽性表達[8]。在本實驗中，結果證明與Gruber等的研究結果一致。造成此種差異的原因可能有多方面的原因：如細胞培養方式的不同、所用檢測方法和手段不同、細胞種屬來源不同等。不同動物纖維環中Ⅰ型膠原和Ⅱ型膠原的含量和分布存在差異[9]。另外，實驗還對培養的纖維環細胞進行甲苯胺藍染色，該細胞具有異染性，表明細胞可以合成分泌蛋白多糖，與相關文獻報道一致[10]。

有些學者認為含20%FBS的DMEM是椎間盤細胞體外培養的理想培養基[11], 本實驗在培養原代細胞時亦采用含20%FBS的DMEM培養基，培養的細胞生長狀態良好。實驗在細胞傳代后使用10%FBS的DMEM培養基培養，培養的細胞生長狀態正常，可見采用此方法既保證了纖維環細胞的正常生長，又盡可能的節約資源。有學者采用Ⅱ型膠原和透明質酸酶消化，有的采用膠原酶和蛋白酶消化，上述方法消化時間較長。本研究先用0.25%胰蛋白酶預消化，然后加入0.02%膠原酶消化基質，可見到組織塊變為絮狀懸浮，同樣取得良好消化效果，且操作時間較短，在三周內能夠達到有效的細胞量。

4　結論

本實驗采用酶消化法成功地分離培養了兔椎間盤纖維環細胞，通過對細胞形態的觀察、細胞外基質免疫組化等檢測手段，證實培養的細胞為纖維環細胞。為體外探討椎間盤退變等疾病的機制提供了可靠的細胞培養模型。但隨著細胞傳代次數的增多，不可避免的出現了去極化和纖維化改變。因此，如何更好地為體外細胞培養提供良好的生存環境以最大限度的保持良好的生長狀態將是未來椎間盤細胞體外培養新的研究方向。

[1]Tow BP, Hsu WK, Wang JC. Disc regeneration: a glimpse of the future[J]. Clin Neurosurg, 2007, 54:122-128.

[2]劉清毅，林宏，向勇，等.小切口椎板開窗髓核摘除術治療腰椎間盤突出癥療效觀察[J].川北醫學院學報,2010,25(3)：0231-0232.

[3]宋超敏，趙呂國，蔚芃.經后路椎間盤鏡髓核摘除術治療腰椎間盤突出癥[J].川北醫學院學報,2003,18(4)：23-24.

[4]Gruber HE, Hanley EN Jr. Recent advances in disc cell biology[J]. Spine, 2003,28:186-193.

[5]Raj PP. Intervertebral disc: anatomy-physiology-pathophysiology- treatment[J]. Pain Pract, 2008, 8(1):18-44.

[6]Rannou F, Pioraudeau S, Foltz V,etal. Monolayer annulus fibrosus cell cultures in a mech anically active environment: Local culture condition adaptation and cell phenotype study[J]. J Lab Clin Med, 2000, 136(5): 412-421.

[7]Sha′ban M, Yoon SJ, Ko YK,etal. Fibrin promotes proliferation and matrix production of intervertebral disc cells cultured in three-dimensional poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold[J]. J Biomater Sci Polym Ed, 2008,19(9):1219-1237.

[8]Gruber HE, Ingram J, Leslie K,etal. Gene expression of types I, II, and VI collagen, aggrecan, and chondroitin-6-sulfotransferase in the human annulus: in situ hybridization findings[J]. Spine J, 2008,8(5):810-817.

[9]Peter J, Roughleyl I,Melchingt F,etalThe structure and degradation of aggrecan in human intervertebral disc[J]. Eur Spine J, 2006, 15(Suppl3): S326-S332.

[10] Rannou F, Pioraudeau S, Foltz V,etal. Monolayer annulus fibrosus cell cultures in a mech anically active environment: Local culture condition adaptation and cell phenotype study[J]. J Lab Clin Med, 2000, 136(5): 412-421.

[11] Pioraudeau S, Monteiro I, Anract P,etal. Phenotype characteristics of rabbit intervertebral disc cells: comparison with cartilage cells from the same animals[J]. Spine,1999, 4(9): 837-844.

Study of culture of rabbit annulus fibrosus cells and biological feature of annulus fibrosus cells in vitro

BAI Yiguang,CHEN Qiaoling,FENG Gang, et al

(1.DepartmentofOrthopaedic,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofOncology,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China;3.TissueEngineeringandStemCellInstitute,TheSecondClinicalCollegeofNorthSichuanMedicalCollege·NanchongCentralHospital,Nanchong637000,Sichuan,China)

ObjectiveTo establish the culture system of the annulus fibrosus cells of rabbit in vitro and identify the cell phenotype. MethodsThe annulus fibrosus cells of rabbit were isolated by enzyme digestion and cultured in monolayer. DMEM containing 20% fetal bovine serum was used in the primary culture. The morphology, structure and biological characteristics of cells were detected by an inverted microscope. The cell phenotype was identified by toluidine blue staining, immunocytochemistry and alkaline phosphatase detection. The growth curve was drawn through MTT.Results Under inverted microscope, annulus fibrosus cells were polygonal and spindle-like in monolayer culture. The cells displayed intense toluidine blue metachromasia. The cells showed positive expression of collagen I and II as well as alkaline phosphatase. ConclusionThe enzyme digestion method can be successfully applied to culture of rabbit annulus fibrsus cells which are accordance with the characteristics of annulus fibrsus cells by phenotypic identification.

Intervertebral disc; Annulus fibrosus cells; Biological feature; Tissue engineering

四川省教育廳資助項目(15ZA0216、15ZB0201)；南充市科技支撐項目(14A0017、14A0022)；川北醫學院科研發展計劃項目(CBY14-A-ZD02、CBY15-A-ZD02)

馮剛，教授，本刊副主編，E-mail: genecloner@163.com

R 392.12

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.08.003

2016-04-22； 編輯： 張文秀)