促紅細胞生成素后處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用

孫倩倩，程遠，孟曉華，史國輝

（華北理工大學附屬醫院，1.腎內科，2.心胸外科，河北 唐山 063000）

論著

促紅細胞生成素后處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷的保護作用

孫倩倩1，程遠2，孟曉華1，史國輝1

（華北理工大學附屬醫院，1.腎內科，2.心胸外科，河北 唐山 063000）

目的探討促紅細胞生成素（EPO）后處理對大鼠腎臟缺血再灌注損傷（IRI）的保護作用。方法將18只健康雄性SD大鼠隨機分為假手術組（Sham組）、缺血再灌注損傷組（IR I組）及EPO后處理組（EPO組）。采用全自動生化分析儀檢測血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）含量；用HE染色觀察病理組織學變化；用免疫組織化學法檢測腎組織中HSP70的表達。結果IR I組血清BUN及C r含量較Sham組明顯升高，EPO后處理組血清BUN及Cr含量介于Sham組和IRI組之間；HE染色檢測發現IRI組腎小管上皮細胞壞死明顯；腎小管管腔擴張，EPO后處理組較IR I組腎小管上皮壞死明顯減輕；免疫組織化學檢測發現HSP70在EPO后處理組表達最強，Sham組表達明顯降低，IRI組表達則介于前兩者之間。結論EPO后處理能增強缺血再灌注損傷過程中HSP-70的表達量，因而有助于減輕腎臟的缺血再灌注損傷。

腎臟；后處理；缺血再灌注損傷；熱休克蛋白70；大鼠

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是臨床上常見的急危重癥，具有較高的發病率和死亡率［1］，而腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是AKI的常見病因。臨床上腎臟缺血再灌注損傷發生隱匿且病程發展迅速，往往很難做到及時預防。短時間內快速完成血流重建是挽救器官缺血損傷最好的方法，但往往在恢復血流時易導致再灌注損傷。因此，研究提高機體內在的保護機制從而減輕腎臟缺血再灌注損傷的方法具有重要的臨床意義。近年來，對腎臟缺血再灌注損傷保護作用的研究多集中在缺血預處理（ischemic preconditioning，IP），缺血預處理已經被證實能夠減輕腎缺血后再灌注損傷［2］。目前最新研究表明，再灌注最初的幾分鐘是決定腎缺血最終結局的關鍵時間段［3］，所以，與缺血預處理相比，對再灌注前進行干預的缺血后處理（ischemic postconditioning，IPO），可能具有更強的可操作性和更好的應用前景。

激活的白細胞及活性氧進入缺血組織，出現顯著的呼吸爆發，產生大量自由基為引起組織器官缺血再灌注損傷的原因之一。文獻［4］報道通過誘導熱休克蛋白在血管壁的表達，抑制了白細胞的浸潤及血管內皮細胞的損傷。

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）臨床主要用于治療腎性貧血以及腫瘤等各種慢性疾病所伴發的貧血，近年來研究發現，EPO有抗氧化、抑制炎癥反應和抗凋亡等功能［5］，對多種組織臟器（如腦、心、腎等）的IRI均有保護作用。目前，相關研究表明EPO預處理對腎臟IRI具有保護作用［6］，但EPO后處理是否可以通過抗氧化機制保護腎臟尚不清楚。本實驗通過建立大鼠IRI模型，探討EPO后處理對大鼠腎臟IRI的保護機制，現報道如下。

1　材料與方法

1.1一般資料

8周齡健康雄性SD（Sprasue-Dawley）大鼠18只（華北理工大學動物中心提供），體重在240～280 g之間，清潔級；飼料為華北理工大學動物中心提供的鈷60滅菌飼料。

1.2儀器與試劑

注射用重組人促紅細胞生成素（rhEPO）3 000 IU/支（沈陽三生制藥廠，批號：201502028S）；Benckman全自動生化儀；Olympus顯微鏡；HSP70免疫組織化學SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

健康雄性SD大鼠18只按隨機數字表法分成3組，每組6只：假手術組（Sham組）、缺血再灌注損傷組（IRI組）和EPO后處理組。Sham組僅開腹，切除右腎，游離左側腎臟，分離腎蒂但不夾閉，45 min后關腹。IRI組手術操作與Sham組相同，僅在切除右腎和游離左腎之后，將左腎動脈夾閉45min再開放血管。EPO后處理組缺血45min，于再灌注前5min rhEPO（3 000 IU/kg）腹腔注射。以上3組持續再灌注24 h后留取血清及腎組織標本。

采用Benckman全自動生化儀測定各組大鼠腎功能指標尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）；腎組織石蠟包埋后切片，行HE染色，Olympus顯微鏡下觀察腎組織病理學改變；采用免疫組織化學法對HSP70在大鼠腎組織內的表達進行分析。

1.4統計學方法

應用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，結果以均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，在方差分析有意義的基礎上，再采用LSD-t檢驗法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1腎功能檢測結果

IRI組大鼠BUN、Cr水平顯著高于Sham組（P＜0.05），EPO后處理組BUN、Cr水平顯著低于IRI組（P＜0.05），見表1。

2.2HE染色顯微鏡觀察結果

HE染色顯示，Sham組大鼠腎組織結構未見明顯異常；各組腎小球光鏡下未見明顯病理改變，IRI組腎小管結構異常，腎間質水腫，大量炎癥細胞浸潤，腎小管上皮細胞壞死，擴張管型形成；EPO后處理組腎小管上皮輕度水腫，炎癥細胞少見，管型罕見，病理損傷程度顯著輕于IRI組，見圖1。

表1　EPO后處理對腎臟缺血再灌注大鼠血漿BUN和Cr含量的影響 （n=6，）

表1　EPO后處理對腎臟缺血再灌注大鼠血漿BUN和Cr含量的影響 （n=6，）

注：1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與IRI組比較，P＜0.05

組別　尿素氮（mmol/L）Sham組　6.91±0.24 IRI組　13.73±0.761）肌酐（μmol/L）52.19±3.39 121.47±9.821）EPO后處理組F值P值73.08±4.261）2）180.318 0.000 9.01±0.501）2）248.082 0.000

2.3免疫組織化學法觀察結果

采用DAB染色，并行核復染，陽性結果為棕黃色顆粒。結果發現HSP70陽性表達主要在細胞質，腎小球為陰性。Sham組中均無或少見HSP70表達，EPO后處理組HSP70表達最強，IRI組HSP70表達稍強于Sham組，但明顯弱于EPO后處理組，見圖2。

圖1　各組大鼠腎臟病理HE染色比較 （×400）

圖2　各組大鼠腎臟免疫組織化學比較 （×400）

3　討論

腎臟缺血再灌注損傷是指腎重新獲得血流后，通過各種途徑最終導致細胞膜損傷，線粒體喪失功能，最后細胞死亡，腎臟功能受損［7］。近年來研究表明，造成腎缺血再灌注損傷的主要機制有：氧自由基增多、炎癥反應、免疫反應、細胞內鈣超載、能量代謝障礙及某些激素代謝失調等［8-10］。其中，氧化是腎臟IR最重要的病理機制之一。

EPO是由CHO細胞發酵表達的有生物活性的蛋白，其最主要的功能就是促進紅系細胞的生長和分化，增加紅細胞的數量，糾正貧血，除此之外，EPO還可以發揮調節因子的作用使機體對缺氧產生適應。最近幾年研究發現，EPO可與機體其他各處的EPO受體結合，發揮直接的組織保護作用，其通過抗氧化凋亡、促進新生血管形成、抑制過度炎癥反應等對心、腦、腎臟缺血再灌注損傷產生保護作用［11-14］。但目前尚未有研究表明EPO后處理對腎臟IRI的影響。

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是細胞在受到外來刺激后誘導合成的一組細胞內蛋白質，具有維持細胞蛋白自穩，提高細胞對應激原的耐受性，保持細胞內環境的穩定性，起到保護細胞的作用［15］。HSP70是分子量約為70 kD的蛋白，在熱刺激、炎癥、缺血和缺氧等情況下都可以誘導產生，對缺血和缺氧較敏感，它對細胞有明確的內源性保護作用而成為HSPs中最受關注、研究最深入的一種［16-17］。國內外多項研究表明熱休克蛋白70在缺血、缺氧及缺血再灌注中能通過抑制氧化應激、抵抗炎性因子對器官產生保護作用。其中，KIM等［18］證明，藥物誘導HSP70生成增加可以明顯減輕腎損傷。

本研究中與Sham組比較，IRI組大鼠光鏡下觀察腎組織損傷嚴重，肌酐和尿素氮水平明顯升高，符合AKI病理表現，說明成功制備腎IRI動物模型。EPO后處理組與IRI組比較，大鼠腎小管上皮細胞壞死，炎癥細胞浸潤及管型明顯減少，肌酐和尿素氮水平顯著下降。除上述病理學及血清學表現外，免疫組織化學結果顯示：Sham組可見無或少見HSP70表達，IRI組HSP70表達稍強，與Sham組比較，差異顯著，但明顯弱于EPO后處理組，差異有統計學意義。根據EPO后處理組HSP70表達明顯增強的研究結果，提示EPO可以促進HSP70的表達，其機制可能是EPO對腎缺血細胞在轉錄和翻譯水平上調HSP70的表達，從而使HSP70合成增加，增強腎臟對缺血及氧化損傷的抵抗力，從而減少大鼠腎缺血再灌注損傷。

綜上所述，EPO可以通過誘導HSP70生成增加，抑制腎小管上皮細胞氧化應激、減輕腎臟缺血，對腎臟產生保護作用。而EPO后處理由于其較缺血預處理有更好的可操作性及安全性，可望作為一種新型治療手段應用于臨床。

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（張蕾編輯）

Effect of erythropoietin postconditioning on renal ischem iareperfusion injury in rats

Qian-qian Sun1，Yuan Cheng2，Xiao-hua Meng1，Guo-hui Shi1
（1.Department of Nephrology，Tangshan North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan，Hebei063000，China；2.Departmentof Cardio-thoracic Surgery，Tangshan North China University of Science and Technology Affiliated Hospital，Tangshan，Hebei 063000，China）

Objective To investigate the effectoferythropoietin（EPO）postconditioningon renal ischemia-reperfusion injury（IRI）in rats.M ethods A total of 18male Sprasue-Dawley（SD）ratswere random ly allocated to three groups: Sham group，ischemia-reperfusion injury（IRI）group，EPO postconditioning group，respectively.Serum blood urea nitrogen（BUN）and creatinine（Cr）were analyzed with automatic biochemical analyzer.Histopathological changes were observed with HE staining.The expression of HSP70 in kidney was checked by immunohistochemistry.Results Serum BUN and serum Cr in IRI group were significantly higher than those in Sham group，while levels of serum BUN and serum Cr in EPO postconditioning group were between the Sham group and IRIgroup.Significant necrosis of tubular epithelial cells and tubular lumen expansion in hematoxylin were found in IRIgroup.Compared with IRI group，tubular necrosis significantly reduced in EPO postconditioning group.Immunohistochemistry showed that the expression of HSP70 in EPO postconditioning group was the strongest，and significantly decreased in the Sham group，and IRIgroup was between them.Conclusions EPO postconditioning enhances the expression of HSP70 after IRI，which helps to reduce kidney injury.

kidney；postconditioning；ischemia-reperfusion injury；HSP70；rats

R 692；R 332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.12.003

1005-8982（2016）12-0011-04

2016-01-19

史國輝，E-mail：saint40@sina.com