人HP1α/pEGFP-N1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)和定位*

吳婷，楊茂，何濤，楊文理,2

（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院:1腫瘤醫(yī)學(xué)研究所；2生物化學(xué)教研室,四川瀘州646000）

人HP1α/pEGFP-N1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)和定位*

吳婷1，楊茂1，何濤1，楊文理1,2

（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院:1腫瘤醫(yī)學(xué)研究所；2生物化學(xué)教研室,四川瀘州646000）

目的：用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白作為標(biāo)記物，觀察人類(lèi)異染色質(zhì)相關(guān)蛋白HP1α在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)及定位。方法：用RT-PCR方法擴(kuò)增獲得HP1α基因編碼序列，將其定向克隆至含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescence protein, EGFP）的真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，構(gòu)建HP1α/pEGFP-N1熒光蛋白融合基因表達(dá)載體。并由脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察其表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位。結(jié)果：雙酶切與測(cè)序結(jié)果表明目的基因序列完全正確；熒光觀察結(jié)果證實(shí)HP1α主要存在于細(xì)胞核內(nèi)。結(jié)論：成功構(gòu)建了目的基因HP1α的真核表達(dá)載體，并在HeLa細(xì)胞中獲得有效表達(dá)和定位。

異染色質(zhì)相關(guān)蛋白；綠色熒光蛋白；基因表達(dá)定位；HeLa細(xì)胞

HP1α（heterochromatin protein 1 homolog alpha）是異染色質(zhì)相關(guān)蛋白1家族成員之一，在進(jìn)化上高度保守[1-2]。人類(lèi)HP1α的編碼基因位于染色體12q13.13的染色盒同源物5（chromobox homolog,CBX5）[1-2]。有資料顯示，HP1α與人類(lèi)多種腫瘤密切相關(guān)，如乳腺癌[2-4]，甲狀腺癌[5]，前列腺癌[6-7],腎癌[8]。HP1α參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，在這些過(guò)程中起著重要的作用，使得HP1α可能作為腫瘤的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)和治療預(yù)后觀測(cè)指標(biāo)。但是，HP1α對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa生物學(xué)行為的影響目前尚不清楚，深入研究HP1α在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制具有重要作用。因此，我們構(gòu)建了可表達(dá)EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）標(biāo)簽的HP1α基因真核表達(dá)載體HP1α/ pEGFP-N1，并將其轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞，對(duì)HP1α在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位進(jìn)行了初步的研究。

1 材料和方法

1.1 材料

組織標(biāo)本取自意外死亡健康成人肝臟組織（已獲家屬知情同意）。ReverTra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶，Oligo（dT）購(gòu)自TOYOTO公司；Rasin、限制性核酸內(nèi)切酶和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自大連寶生物公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自AxyPrep公司；BioFlux質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自BioFlux公司；IPTG、X-gal、瓊脂糖（Agarose）購(gòu)自Sigma公司；HeLa細(xì)胞株購(gòu)自四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心移植免疫研究室；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；大腸桿菌DH5α為本室保存。引物合成和質(zhì)粒的測(cè)序均在上海Invitrogen公司進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA的制備及引物設(shè)計(jì)

采用異硫氰酸胍/苯酚/氯仿一步法提取組織總RNA，作為RT-PCR模板。根據(jù)已知HP1α基因的mRNA全長(zhǎng)序列（GenBank登錄號(hào)GI∶6912291），在編碼區(qū)序列兩側(cè)設(shè)計(jì)引物，分別加上PstⅠ和Bam HⅠ的酶切位點(diǎn)，并去掉3’端終止密碼，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為570bp。引物序列如下：

1.2.2 HP1α基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的擴(kuò)增

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：5×RT buffer（25 mM Mg-Cl2）4 μL，dNTP Mix（各10 mmol/L）2 μL，RNase Inhibitor（10 U/μL）1 μL，Oligo（dT）（10 pmol/μL）1 μL，總RNA（100 ng/μL）2 μL，ReverTra Ace（100 U/ μL）1 μL，0.1%DEPC處理水9 μL，混勻，總體積為20 μL。逆轉(zhuǎn)錄在PCR儀上進(jìn)行。條件為：42℃20 min，94℃5 min，4℃5 min，瞬間離心，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ阅孓D(zhuǎn)錄生成的cDNA為模板進(jìn)行HP1α基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×Pyrobest buffer 5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）4 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，模板2 μL（約0.1 μg），Pyrobest酶（5 U/μL）0.5 μL，混勻，反應(yīng)總體積為50 μL。擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s；30個(gè)循環(huán)后72℃延伸7 min。取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，再以相同條件擴(kuò)增、膠回收目的片段。

1.2.3 真核表達(dá)載體HP1α/pEGFP-N1的構(gòu)建與鑒定

將HP1α目的片段，定向克隆至真核表達(dá)載體pEGFP-N1中。以PstⅠ和Bam HⅠ分別雙酶切質(zhì)粒pEGFP-N1和HP1α目的片斷，膠回收純化后再將二者以1∶3～10（摩爾比）混合。16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂板于卡那霉素陽(yáng)性的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)12～14 h。挑取單克隆，37℃，230 rpm/h,培養(yǎng)6～8 h，小量抽提質(zhì)粒，PstⅠ/Bam HⅠ雙酶切鑒定，并將陽(yáng)性克隆送測(cè)序。測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆命名為HP1α/pEGFP-N1，并大量提取質(zhì)粒，用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa用RPMI1640培養(yǎng)液（含10%新生牛血清，100 U/mL的青霉素/鏈霉素）常規(guī)培養(yǎng)（5%CO2，37℃，飽和濕度）、傳代。實(shí)驗(yàn)分為兩組，對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N1；實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒HP1α/pEGFP-N1。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板（1×105個(gè)細(xì)胞/孔），細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，按如下方法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染：每孔2.4 μg質(zhì)粒DNA和6 μL脂質(zhì)體Lipofectamine 2 000。首先取6 μL脂質(zhì)體加入244 μL無(wú)血清、無(wú)抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，輕柔混勻，室溫放置5 min，即為溶液A；再取2.4 μg質(zhì)粒pEGFP-N1或HP1α/pEGFP-N1加入無(wú)血清、無(wú)抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，終體積250 μL，混勻，即為溶液B。將溶液A逐滴加入溶液B，輕柔混勻，室溫放置20～30 min；然后將混合物逐滴加入各孔，再以不含血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)足2 mL/孔。37℃培養(yǎng)5 h后，換為RPMI1640全培養(yǎng)基（含10%新生牛血清和100 U/mL的青霉素/鏈霉素）繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 熒光顯微鏡觀察

轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡（Olympus）下觀察HP1α/pEGFP-N1在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)和定位情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒HP1α/pEGFP-N1的構(gòu)建

人HP1α基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見(jiàn)約570 bp的特異性目的條帶（圖1），與預(yù)期的結(jié)果一致。目的條帶定向克隆至pEGFP-N1載體，雙酶切后電泳可見(jiàn)約570 bp的插入片段（圖2）。測(cè)序結(jié)果證實(shí)，插入片段序列與HP1α mRNA編碼序列完全一致（圖3），且插入方向正確。

圖1 目的基因HP1α的PCR產(chǎn)物

圖2 重組質(zhì)粒HP1α/pEGFP-N1的構(gòu)建和鑒定

圖3 重組質(zhì)粒HP1α/pEGFP-N1的測(cè)序圖譜

2.2 熒光顯微鏡計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)染效率

以pEGFP-N1空載體為對(duì)照組，將HP1α/ pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞。48 h后熒光顯微鏡鏡下觀察，可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，陽(yáng)性率約60%（見(jiàn)圖4 a,4 b），說(shuō)明Lipofectamine 2 000介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞的效率較高。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞也有較強(qiáng)的綠色熒光，但陽(yáng)性率較低，約30%（見(jiàn)圖4 c,4 d）。

圖4 重組質(zhì)粒HP1α/pEGFP-N1在HeLa細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率和表達(dá)（×100）

2.3 HP1α/pEGFP-N1重組質(zhì)粒在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)和定位

對(duì)照組（pEGFP-N1）和實(shí)驗(yàn)組（HP1α/pEGFPN1）細(xì)胞均有較強(qiáng)的綠色熒光蛋白表達(dá)，在對(duì)照組中，GFP蛋白產(chǎn)生的熒光均勻地分布于整個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中（圖5 a）。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，熒光主要聚集在細(xì)胞核內(nèi)（圖5 b），表明該細(xì)胞表達(dá)了人HP1α/GFP融合蛋白，并且HP1α蛋白主要在核內(nèi)表達(dá)。

圖5 HP1α在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)和定位（×200）

3 討論

異染色質(zhì)相關(guān)蛋白1（heterochromatin protein 1, HP1）是一個(gè)龐大的蛋白質(zhì)家族，最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，它在進(jìn)化上高度保守，幾乎存在于所有真核生物，從裂殖酵母、植物到人類(lèi)[1-2]。HP1蛋白家族由一系列稱(chēng)為染色盒（chromobox,CBX）的基因編碼，在哺乳動(dòng)物HP1蛋白家族有HP1α、HP1β、HP1γ三種異構(gòu)體。HP1蛋白的序列和結(jié)構(gòu)可分為三部分：N-端的染色域（chromodomain）——結(jié)合基因沉默的表遺傳標(biāo)志[1,2]即第9位賴(lài)氨酸二或三甲基化的組蛋白H3（Di-met-H3K9,Tri-met-H3K9）；C-端染色陰影域（chromoshadow domain）——參與同、異二聚化并與其他蛋白質(zhì)相互作用；中間的可變鉸鏈區(qū)——包含核定位序列。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，HP1α主要定位于異染色質(zhì)區(qū)，其最常見(jiàn)功能是參與異染色質(zhì)形成，并通過(guò)與甲基化的H3K9結(jié)合間接或直接與幾個(gè)非組蛋白相互作用發(fā)揮多種功能：從轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、染色質(zhì)修飾和復(fù)制到DNA修復(fù)、細(xì)胞核構(gòu)建和染色體維持等多方面參與細(xì)胞過(guò)程[1-2、9]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，了解HP1α的亞細(xì)胞定位將有助于對(duì)其的功能的深入研究。

本研究中以正常成人肝組織總RNA為模板，在人HP1α上游引物加入PstⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物加入Bam HⅠ酶切位點(diǎn)并去除HP1α基因3’末端的終止密碼。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增獲得目的基因，并通過(guò)分子克隆技術(shù)將HP1α cDNA置于EGFP基因的上游，與之形成融合蛋白。所用的表達(dá)載體pEGFP-N1可編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP），它是由綠色熒光蛋白（GFP）中65位絲氨酸被蘇氨酸取代、64位苯丙氨酸被亮氨酸取代而形成的突變體。EGFP在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)量更高，經(jīng)488 nm紫外光激發(fā)可產(chǎn)生熒光強(qiáng)度更強(qiáng)的綠色熒光[10]，可以直接在熒光顯微鏡下觀察目的基因在活體中的表達(dá)而不必破壞組織細(xì)胞或添加底物。因此，EGFP作為一種良好的報(bào)告基因和篩選標(biāo)記，在基因表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞分化及蛋白質(zhì)的胞內(nèi)定位[11]與功能轉(zhuǎn)化等多種研究中得到廣泛應(yīng)用[12]。

在研究中我們還發(fā)現(xiàn),HP1α/EGFP融合蛋白在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后的表達(dá)效率比單獨(dú)的EGFP更低，熒光強(qiáng)度更弱。pEGFP-N1質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后12 h即有表達(dá)，而HP1α/EGFP融合蛋白在細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后才看到其低水平表達(dá)，并且表達(dá)效率更低。我們推測(cè)可能是由于HP1α與EGFP形成的融合蛋白，在空間結(jié)構(gòu)上可能存在相互作用，影響了蛋白的正確折疊而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降。

總之,本研究構(gòu)建了HP1α/pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP作為HP1α蛋白在HeLa細(xì)胞中表達(dá)和定位的標(biāo)簽，為進(jìn)一步研究該基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其機(jī)制提供了有力的手段。

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（2016-05-16收稿）

Construction and expression of human pEGFP-N1-HP1α in eukaryotic cells

Wu Ting1,Yang Mao1,He Tao1,Yang Wenli1,21Institute for Cancer Medicine,2Department of Biochemistry and Molecular Biology,School of Preclinical Medicine,Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province 646000,China

Objective：To observe the expression and localization of human HP1α,an eukaryotic expression vector HP1α/EGFP-N1 was constructed and introduced into HeLa cells.Methods：HP1α cDNA were obtained by RT-PCR,and cloned into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1 to construct HP1α/EGFP-N1 that was transfected into HeLa cells with Lipofectamine 2000.The expression and location of HP1α in transfected cells was detected by fluorescence microscope.Results：Diagnostic restriction digestion and sequencing analysis verified the identity of the plasmid,HP1α/EGFP-N1.After transfection,HP1α is localized in the nucleus of HeLa cells. Conclusion：Eukaryotic expression plasmid,HP1α/EGFP-N1 is successfully constructed and expressed effectively in HeLa cells.

HP1α;Enhanced green fluorescent protein（EGFP）;Gene expression;HeLa cells

R78

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.012

*四川省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（川教函[2011]538號(hào)）

吳婷（1989-），女，研究實(shí)習(xí)員，碩士

楊文理（1975-），女，副教授，博士。E-mail：ywl0621@163.com