不同強度重復經顱磁刺激對腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響*

劉文賢，劉騰飛，張鑫，侯蓓蓓，余茜

（1西南醫科大學附屬醫院康復科，四川瀘州646000；2四川省人民醫院康復科）

不同強度重復經顱磁刺激對腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響*

劉文賢1，劉騰飛2，張鑫2，侯蓓蓓2，余茜1

（1西南醫科大學附屬醫院康復科，四川瀘州646000；2四川省人民醫院康復科）

目的:研究不同強度重復經顱磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation,，rTMS）對腦梗死大鼠條件性恐懼記憶的影響。方法:雄性成年SD大鼠40只，體重200～250 g，采用改良Zea longa線栓法對大鼠制作右側大腦中動脈閉塞的腦梗死模型。建模成功的大鼠隨機分為模型組及40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）強度刺激組，每組8只，另外假手術組8只。各刺激組大鼠于建模成功后第5 d開始按照設定參數分別接受磁刺激，連續5 d，假手術組和模型組置于相同磁場環境，但不接受磁刺激。治療結束后，給予各組大鼠相同足底電擊（55 V，2 s），在24 h后檢測大鼠在5 min內的僵直持續時間。結果:各刺激組大鼠在接受足底電擊24 h后的僵直持續時間均明顯高于模型組（P＜0.01）,并且隨著刺激強度的增加，大鼠在24 h后的僵直持續時間也明顯增長（P＜0.01）。結論:rTMS能促進腦梗死大鼠記憶功能的恢復，并隨著刺激強度的加強，大鼠記憶能力的恢復程度亦增強。

腦梗死；重復經顱磁刺激；恐懼記憶

腦梗死（cerebral infarction）是指因腦部血液供應障礙，缺血、缺氧所導致的局限性缺血性壞死或軟化[1]。作為一種高發病率和高致殘率的疾病，腦梗死給人類健康和生命帶來威脅的同時也影響患者日常生活能力，給社會及家庭帶來沉重的負擔。重復經顱磁刺激技術（repetitive transcranial magnetic stimulation,，rTMS）是一種利用脈沖磁場作用于中樞神經系統（主要是大腦），改變皮層神經細胞的膜電位，使之產生感應電流，影響腦內代謝和神經電活動，從而引起一系列生理生化反應的磁刺激技術，作為一種新的精神神經系統治療技術，具有無痛、無創、安全和操作簡便等優點，目前已廣泛應用于治療帕金森病、癲癇、抑郁癥、腦梗死、脊髓損傷等疾病的臨床治療中，并取得了較好的療效[2-3]。條件性恐懼的形成是一種學習和記憶的過程，本研究旨在通過對腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的觀察來研究rTMS對腦梗死后大鼠學習記憶功能的恢復作用，同時探索其治療強度與功能恢復程度的關系，為rTMS將來更好地應用于臨床腦梗死患者的治療提供指導依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級成年SD雄性大鼠，體重約200～250 g（由第三軍醫大學實驗動物中心提供），鼠齡12周，在飼養籠里給予12 h光/暗周期，可自由采食水和食物，隨機取8只作為假手術組，其余大鼠制成右側大腦中動脈栓塞腦梗死模型，將造模成功的大鼠隨機分為模型組及40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）強度刺激組，每組8只。

1.2 儀器

武漢依瑞德公司生產的磁場刺激儀（CCY-1型）；自主設計制成的恐懼記憶條件訓練箱[4]：訓練箱材料為有機玻璃（20 cm×20 cm×20 cm），箱底由13根直徑為5 mm（間隔10 mm）不銹鋼絲作為電極的電極板。

1.3 腦梗死動物模型的制作

參照改良Zea longa線栓法[5]制成右側大腦中動脈缺血模型。動物蘇醒后表現為提尾時左側前肢內收屈曲；同側Horner氏征；爬行時向左劃圈；站立時左側傾倒。凡具有上述體征者列入研究對象。共用大鼠100只，有32只符合入選條件并存活到規定時間。假手術組僅作右側頸內動脈結扎，術后無病理行為學改變。

1.4 治療方法

刺激組在造模成功后第2 d行rTMS治療，將大鼠頭部固定，使其在刺激過程中保持清醒、安靜和舒適。磁場線圈中心處于大鼠囟門右旁開0.5 cm處。設計刺激參數為：刺激頻率1 Hz，刺激強度為40%（0.76 T）、60%（1.14 T）、80%（1.52 T）輸出強度；3組/ d，5序列/組，20次/序列，每個序列間隔10 s，每組間隔60 s，連續刺激5 d，每天于14:00～15:00實施刺激，假手術組和模型組置于相同磁場環境，但不接受磁刺激。

1.5 記憶能力評價[6]

實驗分為訓練和檢測兩個部分，各組大鼠均于治療結束后第2 d行場景性條件性恐懼實驗。每次使用電擊箱前用95%乙醇擦拭箱底和鋼絲，將大鼠分別置于無聲，無特殊氣味的測試箱中，適應3 min后，開始給予短暫足底電擊（55 V，2 s）共6次，2次足底點擊時間間隔平均為90 s（60～120 s隨機變化），最后1次電擊結束后30 s將大鼠放回飼養籠。訓練結束24 h后進行記憶形成和保持能力的測試，將大鼠放入同一電擊箱中無電刺激呈現，觀察并用秒表記錄大鼠5 min內僵直（Freezing）反應時間。僵直的判定標準是動物接受刺激信號后,除呼吸運動外,全身其他軀體運動全部停止的狀態。在這一行為模型中，僵直反應時間的長短反映大鼠對電擊這一場景的恐懼記憶程度。

1.6 統計學分析

采用SPSS 17.0版統計學軟件包進行數據處理，每組樣本數據用均數±標準差表示，多個樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

與假手術組相比，模型組大鼠恐懼記憶能力明顯下降，rTMS組大鼠恐懼記憶能力均明顯高于模型組，各組間差異均有統計學意義（P＜0.01）,在刺激組中，隨著刺激強度的增加，大鼠在24 h的僵直時間也明顯增長，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

表1 不同強度rTMS對腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的影響

3 討論

重復經顱磁刺激（rTMS）是1991年在經顱磁刺激基礎上發展起來的新的神經電生理技術，無痛無創、操作方便、安全可靠，能影響局部和遠隔皮層功能，實現皮層功能區域性重建，影響多種神經遞質和基因表達水平，目前在抑郁癥、帕金森病、癲癇、神經性疼痛、脊髓損傷和腦卒中等疾病臨床治療中得到廣泛的應用。臨床研究表明，rTMS能促進腦梗死患者肢體功能的恢復和提高患者的日常生活能力[7]。目前研究中腦梗死大鼠學習記憶行為評估實驗多以Y型迷宮和水迷宮為主[8-9]，條件性恐懼的形成也是一種學習和記憶的過程，本研究以條件性恐懼記憶作為學習記憶評估實驗，結果顯示rTMS能促進腦梗死大鼠記憶功能的恢復，并隨著刺激強度的加強，腦梗死大鼠記憶能力的恢復程度亦增強。

目前，有關rTMS能促進腦梗死大鼠記憶能力恢復可能的機制研究較多。已有研究報道[10]，rTMS能促進腦梗死大鼠海馬突觸素（Syn）的表達，Syn是突觸囊泡的一種特異標志性膜蛋白，其數量和分布密度可間接反映突觸的密度，突觸作為神經元之間在功能上發生聯系的部位，其密度增多，海馬區神經元之間的傳遞和聯系隨之增強；此外，磁刺激也可增加腦梗死側皮層腦源性神經營養因子（BDNF）的表達，促進神經元再生,刺激軸突的芽生和新突觸的形成，抑制促凋亡蛋白Bax、BAD等，從而對腦梗死部位產生多種神經保護效應[11]；另有研究報道[12]，rTMS治療也能抑制缺血組織神經細胞的凋亡和增加神經可塑性，可用于腦梗死后亞急性期記憶功能恢復的治療；另外，rTMS能調節miR-25/p57信號通路，能促進腦梗死后腦室下區成體神經干細胞的增殖，加強腦梗死后的自我修復能力[13]。

rTMS對腦梗死患者療效作用與許多因素有關，主要因素則是刺激參數的設置如強度、頻率、刺激持續時間等，本實驗在保證除強度外的其它參數相同的前提下發現隨著刺激強度的加強，大鼠記憶能力的恢復程度亦增強。有文獻報道，這可能與磁刺激能影響星形膠質細胞的遷移有關，且隨著刺激強度的增強，星形膠質細胞遷移能力也增強[14]。在保證治療安全的前提下，本研究僅探討不同強度重復經顱磁刺激對腦梗死后大鼠條件性恐懼記憶的影響，對其余參數如頻率、刺激總量等對腦梗死治療的量效關系有待進一步基礎和臨床研究。

考文獻參

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4.宋海濱,李春林,金毅,等.兩種小鼠恐懼記憶模型建立的比較研究[J].中國行為醫學科學,2006,12:76-77.

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6.王兵廖,勇仕,梁日初,等.條件恐懼記憶形成中大鼠海馬CA1區鈣調蛋白激酶和蛋白磷酸酶1蛋白表達及活性變化[J].國際神經病學神經外科學雜志,2012,39:494-497.

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8.黃杰,顏南,王正東.康復訓練對腦梗死大鼠學習記憶能力減退的影響[J].臨床研究,2014,07:106-107.

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10.周寧,吳洪陽,黃本榮,等.重復經顱磁刺激對腦缺血大鼠海馬突觸素表達及學習記憶的影響[J].神經損傷與功能重建,2015,1:05-07.

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12.Kyung Jae Yoon,Yong Taek Lee,Tai Ryoon Han.Mechanism of functional recovery after repetitive transcranial magnetic stimulation（rTMS）in the subacute cerebral ischemic rat model:neural plasticity or anti-apoptosis[J]. Exp Brain Res,2011,2:549-556.

13.Feng Guo,Xiaohua Han,Jinghui Zhang,et al.Repetitive transcranial magnetic stimulation promotes neural stem cell proliferation via the regulation of MiR-25 in a rat model of focal cerebral ischemia[J].PLOS ONE,2014,10:09-10.

14.李哲,方征宇,黃曉琳.不同強度經顱磁刺激對星形膠質細胞遷移的影響及其機制研究[J].中華物理醫學與康復雜志，2010，4:249-252.

（2016-04-23收稿）

Effects of repetitive transcranial magnetic stimulation with different intensity on the conditioned fear memory in rats with cerebral infarction

Liu Wenxian1,Liu Tengfei2,Zhang Xin2,Hou Beibei2，Yu Qian11Department of Thoracic Surgery,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan Province，646000,China；2Department of Thoracic Surgery Sichuan Province Peoples Hospited

Objective:To study the effect of repetitive transcranial magnetic stimulation（repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS）with different intensity on the conditioned fear memory in rats with cerebral infarction.Methods:Forty male adult sprague-dawley rats,weighing 200～250 g,were performed right middle cerebral artery occlusion（MCAO）by modified Zea longa suture method to create cerebral infarction model.Model rats were randomly divided into a model group,40%（0.76 T）,60%（1.14 T）,80%（1.52 T）intensity stimulation group,and a sham operation group（n=8 in each group）.The rats in the rTMS group were treated with magnetic stimulation on the day after the infarction for a total of 5 days.The sham group and the model group were placed in the same magnetic field environment,but were not given any magnetic stimulation.At the end of treatment, each group was given the same foot shock,and the duration of Stupor response was recorded for 5 minutes after 24 h.Results:The duration of stupor response in rTMS groups receiving foot shock after 24 h was significantly longer than those in the model group（P＜0.01），and in rTMS groups,with the increasing intensity of the stimulation the durations of stupor response after 24 h were also significantly increased（P＜0.01）.Conclusion：rTMS can promote the memory recovery in rats with cerebral infarction,and with the increasing intensity of the stimulation the degree of memory recovery is also enhanced.

Cerebral infarction;Repetitive transcranial magnetic stimulation;Fear memory

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2016.06.018

*四川省科技廳科研基金資助項目（編號:2014JY0032）

劉文賢（1991-），女，住院醫師，碩士生

余茜（1968-），女，教授，博士，現四川省人民醫院康復科工作。E-mail：Ygswcll@163.com